响应面分析法优化女贞子水溶性多糖提取工艺

黄宝旭，刘军海，张静

（聊城大学化学化工学院，山东聊城，252059）

响应面分析法优化女贞子水溶性多糖提取工艺

黄宝旭，刘军海，张静

（聊城大学化学化工学院，山东聊城，252059）

研究女贞子水溶性多糖的提取工艺。在单因素试验基础上选取试验因素与水平，根据中心组合（Box-Benhnken）试验设计原理采用三因素三水平的响应面分析法，依据回归分析确定各工艺条件的影响因子，以女贞子水溶性多糖提取率为响应值作响应面和等高线。在分析各个因素的显著性和交互作用后，得出女贞子水溶性多糖浸提的最佳工艺条件为：料水比1∶15（g/mL），浸提温度94℃，浸提时间3 h；浸提2次，女贞子水溶性多糖的实际一次提取率可达5.260%。

女贞子；水溶性多糖；提取；响应面分析

Abstract:The extraction techniques of water-soluble polysaccharide from Fructus ligustri lucidi（WPFLL）were studied in this paper.On the basis of single factor experiments，the optimum conditions for the extraction of WPFLL were obtained through Box-Benhnken center-united experiment design and Response Surface Methodology.The results showed that the optimum conditions of WPFLL extraction were as follows：extraction temperature of 94 ℃,the ratio of material to water of 1∶15,and extraction time of 3 h，extraction twice.Under such condition the extraction rate could be up to 5.260%at one extraction.

Key words：Fructus ligustri lucidi;water-soluble Polysaccharide;Extraction;Response surface methodology

女贞子（Fructus ligustri lucidi）系木犀科植物女贞的成熟果实,女贞子多糖（polysaccharide from Fructus ligustri lucidi）为其有效成分,根据传统中医理论，肝肾不足可导致人体衰老，女贞子可防治因肝肾不足引起的头晕耳鸣，双目昏糊，腰膝酸软，须发早白[1]。现代研究表明，女贞子多糖具有抗氧化[1]、增强免疫[2-5]、抗衰老作用[6-7]。文献报道，女贞子中的多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖及岩藻糖种糖组成,可以提高机体的非特异性免疫功能,对细胞的免疫效应有促进作用[8]。因此开发和利用女贞子多糖对制药和保健品工业具有重要的意义。国内众多的研究集中在女贞子多糖的药理生理功能以及化学成分方面[1-11]，对于女贞子多糖提取工艺的研究较少，尤其是利用响应面法对女贞子水溶性多糖提取工艺的优化，未见文献报道。

响应面法(RSM)由一组数学和统计学方法组成，可用于确定各因素及其交互作用在加工中非独立变量的影响，可以精确地表述因素和响应值之间的关系，是一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法，广泛应用于化学化工、生物工程、食品工业等方面[12-13]。为此笔者在单因素实验的基础上，利用响应面分析法对女贞子水溶性水溶性多糖提取工艺条件进行了优化，获得最佳提取工艺条件，以期对女贞子的深加工和女贞子多糖产品的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

女贞子（江苏产，购于聊城某药店）、优质工业酒精、苯酚（AR）、浓硫酸（AR）、蔗糖（AR）(以上试剂均购于天津化学试剂三厂)。

1.2 仪器

AR-1104电子天平：奥克斯国际贸易上海有限公司；DKB-501A型超级恒温槽：上海精宏试验设备有限公司；SHB-11循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 水溶性水溶性多糖含量与提取率的测定

1.3.1.1 标准曲线的绘制[14]：

精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖36.50 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6 mL，分别置于 10 mL 容量瓶中，分别加入蒸馏水补至2 mL，然后分别再加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后置40℃水浴中加热15 min，取出置冷水中冷却10 min，同时用2.0 mL蒸馏水做空白，用分光光度计在波长480 nm处测定吸光度，得标准曲线方程：C=17.9533A+2.1724，相关系数r=0.9950。

1.3.1.2 水溶性水溶性多糖含量与提取率的测定

水溶性水溶性多糖含量与提取率的测定采用苯酚－硫酸法[12-14]，精密吸取样品溶液2 mL置于10 mL容量瓶中，并加水稀释定容。然后精密量取0.5 mL，至于10 mL容量瓶中，加蒸馏水补至2 mL,然后再加入5%的苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后置40℃水浴中加热15 min，取出置冷水中冷却10 min，同时用2.0 mL蒸馏水做空白，用分光光度计在波长480 nm处测定吸光度。水溶性多糖提取率用式（1）计算：

1.3.2 提取方法

1.3.2.1 水溶性多糖提取工艺流程

女贞子→干燥→粉碎（过20目）→石油醚脱脂→90%浓度乙醇回流→滤渣→蒸馏水回流→抽滤得滤液→定容→测定水溶性多糖含量

1.3.2.2 提取方法

精确称取女贞子粉末约5.0 g于250 mL圆底烧瓶中，加入30 mL石油醚，在80℃下回流1 h用于脱脂，抽滤得滤渣，在滤渣中再加入90%乙醇80 mL加热回流1 h，过滤，滤渣用10 mL 90%乙醇洗涤两次，以彻底除去单糖、低聚糖等成分。然后再向滤渣中加入一定量的蒸馏水，在一定温度下回流一定时间，提取水溶性多糖，滤液于250 mL容量瓶中定容后，取2 mL试液定容在10 mL容量瓶中。精密移取0.5 mL按上述方法测定样品吸光度，计算水溶性水溶性多糖含量。

2 结果与分析

2.1 提取时间对女贞子水溶性多糖提取率的影响

女贞子中含单糖、双糖、低聚糖、醇溶性蛋白质等物质，由于水溶性多糖溶于水而不溶于高浓度乙醇，根据此原理先用90%的乙醇回流1 h，来除去单糖、低聚糖等对水溶性多糖提取率有影响的物质，然后用蒸馏水提取水溶性多糖。

固定温度80℃，用30 mL石油醚和80 mL 90%乙醇分别回流1 h后，过滤去除液体，然后滤渣在80℃，固定料液比1∶20的情况下，分别回流提取0.5、1.2、3、4、5 h，试验结果见图 1。

由图1中可看出，多糖提取率随时间逐渐增大，当达到3 h提取率最大，而在提取4 h、5 h变化不大，基本趋于平缓。同时从提取的多糖溶液可以看出，随着时间的增加，多糖颜色加深。提取时间越长越有利于多糖的提取。但加热时间若过长，能耗明显要增加，而且水溶性多糖可能要发生水解，从节约能源考虑，减少生产周期考虑，从经济考虑适宜提取时间选择3 h左右为宜。

2.2 提取温度对女贞子水溶性多糖提取率的影响

提取时间是影响女贞子提取率的重要因素，且影响成本。固定温度80℃，用30 mL石油醚和80 mL 90%乙醇分别回流1 h后，过滤，滤渣然后在80℃，固定料液比 1∶20 下，分别在 65、70、75、80、85、90、95、98℃下，回流1 h进行提取，试验结果见图2。

由图2中可知，在85℃前，多糖提取率随温度的升高而增大，在80℃前增加较为显著，以后增加不太明显，温度在80、85、90℃的提取率曲线较为平缓，同时从提取的多糖溶液可以看出，随着温度的升高，多糖溶液颜色加深。考虑到高温可能对多糖的结构与活性有一定的影响，温度过高多糖易产生降解，而且温度过高，水分容易挥发，给操作带来不便，所以适宜提取温度选择85℃左右作为宜。

2.3 料液比对女贞子水溶性多糖提取率的影响

料液比对提取率具有重要影响，水量多有利有水溶性多糖的扩散传质，但水量过多增加蒸发处理的困难。固定温度80℃，用30 mL石油醚和80 mL 90%乙醇分别回流1 h后，过滤，滤渣然后在在80℃，料液比分别为 1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32（g/mL）下回流1 h进行试验，试验结果见图3。

由图3中可看出，多糖提取率随料液比的增加先增大后减小，在1∶16时有最大值，然后随着料液比的增加，提取率不在增加，并且有下降的趋势，因此最佳提取料液比选择1∶16左右为宜。

2.4 提取次数对女贞子水溶性多糖提取率的影响

提取次数决定操作成本，操作次数越多，成本越高，且工艺用水量大。固定温度80℃，用30 mL石油醚和80 mL 90%乙醇分别回流1 h后，过滤，滤渣在固定料水比 1∶20，分别提取 1、2、3、4 次，测定提取率，试验结果见图4。

由图4可知，提取次数的增多能增加提取总量，在提取一次后，残渣中水溶性多糖含量明显降低，提取4次后其多糖提取率已经很低。从节省能耗、减少操作工序以及缩短生产周期考虑，提取次数取2次为宜。

2.5 响应面法优化提取工艺条件

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理[15]，综合单因素影响试验结果，选取提取温度、料水比、提取时间对女贞子水溶性多糖提取率影响显著的三个因素，在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法进行试验设计，分析因素与设计见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factor and level of RAS

对提取温度，料水比，提取时间作如下变换X1=（T-85）/10，X2=（t-2）/1，X3=（z-16）/4，以 3 次试验所得水溶性多糖提取率的平均值为响应值（Y），试验设计与试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及数据处理Table 2 Program and experimental results of RSA

其中15个试验中，1-12是析因试验，13-15是中心试验，用来估计试验误差。采用SAS8.0软件处理得响应面分析结果见图5～图7。

采用SAS RSREG程序对响应值与各因素进行回归拟合后，得到回归方程：

表3 女贞子水溶性多糖浸提回归分析结果Table 3 Results of regression analysis

注：＊为显著（P＜0.05）；＊＊为高度显著（P＜0.01）。

回归模型中各变量对指标（响应值）影响的显著性，由F检验来判定，概率P（F＞Fα）的值越小，则相应变量的显著程度越高。由表3可以看出，各因素中一次项 X1、X2、X3是高度显著的，二次项 X1X1、X2X2、X3X3也是高度显著的，其次是交互项X1X2、X1X3是显著的，由此可见，各具体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。回归模型也是高度显著的,相关系数R2=3.4221/3.4610=98.88%,说明响应值（提取率）的变化有98.88%来源于所选变量，即提取温度、提取时间和料水比。因此，回归模型可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。对回归方程取一阶偏导数等于零，整理可得如下3式：

式（1）、式（2）、式（3）联立方程组，解得 X1=0.823，X2=0.748，X3=-0.227，代入前述的变换公式得到提取温度 T=93.23 ℃，提取时间 t=2.75 h，水料比 Z=1∶15.09，但考虑到实际操作的便利，将女贞子水溶性多糖的最佳提取条件工艺修正为提取温度94℃，料水比1∶15，提取时间3.0 h，提取次数为2次。在此修正条件下，一次实际测得提取率为5.260%，回归模型预测提取率理论值可达5.053%。实际测定值比理论预测值高3.94%。

2.6 验证试验结果

在最佳提取温度94℃，最佳料水比1∶15，最佳提取时间3.0 h的工艺条件下，进行提取试验，3次试验结果见表4。

表4 最佳工艺条件下的试验结果Table 4 Test results in regression analysis

2.7 结论

通过单因素试验设计，以及在此基础上通过设计三因素三水平响应面法实验，建立了响应值与各因素之间的数学模型，依此模型可以预测理论提取率。根据此二次回归模型，确定女贞子水溶性多糖的提取最佳工艺参数：料水比1∶15，浸提温度94℃，浸提时间3.0 h，浸提2次。按照此工艺条件提取女贞子水溶性多糖的提取率较高，女贞子水溶性多糖的实际一次提取率可达5.260%。

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Optimization of the Extraction Technique of Water-soluble Polysaccharide from Fructus Ligustri Lucidi by Response Surface Methodoloy

HUANG Bao-xu,LIU Jun-hai,ZHANG Jing
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Liaocheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China）

2010-04-26

黄宝旭（1973—），男（汉），副教授，博士，研究方向：植物活性成分分离纯化技术。