MMP-2 VEGF在肺腺癌细胞中的表达及其意义

方长清 郭晓宁 李 淼李长思李建华

(中国医科大学基础医学院病理教研室及中国医科大学附属第一医院病理科,辽宁沈阳110001;1辽宁中医药大学附属第二医院病理科,沈阳110034;2中国医科大学附属第一医院康复科,沈阳110001)

MMP-2 VEGF在肺腺癌细胞中的表达及其意义

方长清 郭晓宁 李 淼1李长思2李建华＊

(中国医科大学基础医学院病理教研室及中国医科大学附属第一医院病理科,辽宁沈阳110001;1辽宁中医药大学附属第二医院病理科,沈阳110034;2中国医科大学附属第一医院康复科,沈阳110001)

目的 研究探讨基质金属蛋白酶2(MMP-2)及血管内皮生长因子(VEGF)在胸腔积液、痰液中肺腺癌细胞的不同表达及二者在肺癌细胞侵袭转移过程中的相互关系。方法 选择胸腔积液、痰液共计264例癌性及异型增生细胞标本经免疫细胞化学方法分别检测MMP-2 VEGF的表达情况。结果 免疫细胞化学结果显示:MMP-2在胸腔积液中腺癌细胞、异型增生上皮细胞的表达率分别为71.7%(99/138)、16.7%(6/36),在胸膜炎和结核病变典型良性胸腔积液增生上皮细胞中不表达;在痰腺癌细胞中的表达率为39.1%(27/69),统计结果显示MMP-2在恶性胸腔积液腺癌细胞中的表达率明显高于在异型增生的上皮、增生的上皮及痰腺癌细胞的表达率(P均<0.05)。VEGF在胸腔积液中腺癌细胞、异型增生上皮细胞的表达率分别为89.1%(123/138)、33.3%(12/36),在胸膜炎和结核病变典型良性胸腔积液增生上皮细胞中不表达;在痰腺癌细胞中的表达率为47.8%(33/69),VEGF在恶性胸腔积液腺癌细胞中表达率明显高于在异型增生的上皮细胞、增生的上皮细胞及痰腺癌细胞的表达率(P均<0.05),且MMP-2同VEGF总阳性表达率之间成正相关(r =0.867,P=0.049)。结论 MMP-2 VEGF在胸水腺癌细胞中高表达,可能与肺腺癌的转移、侵袭有关;两者联合做免疫细胞化学检查对肺腺癌细胞病理诊断有辅助意义。

基金金属蛋白酶-2;血管内皮生长因子;肺腺癌细胞

恶性肿瘤的浸润和转移是一个多阶段、多步骤、多种成分参与的序贯连续过程。癌细胞脱离原发灶、细胞外基质的降解、肿瘤新生血管的形成是肿瘤转移的重要原因。

基膜是阻止肿瘤细胞浸润侵袭转移的一道天然屏障。正常基膜是由Ⅳ型胶原等成分构成,为一致密的网状结构,固有细胞不能正常通过。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一类锌离子依赖的细胞外蛋白水解酶,可降解基底膜,促进恶性肿瘤细胞的侵袭和转移[1]。近年来的研究表明,肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶中, MMP-2(明胶酶A,相对分子质量为72000KD的Ⅳ型胶原酶)是降解Ⅳ型胶原最主要的酶,其在肿瘤的血管化、肿瘤细胞的浸润和转移灶的形成过程中均起重要作用[2]。Thomas等[3]报道,在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中MMP-2检出率为41%,Delebecp等[4]研究表明, MMP-2与NSCLC的浸润能力有关,可能是一种有用的预后指标。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种同源二聚体糖蛋白,是目前已知的最关键的血管生成因子,能够特异性的与血管内皮细胞膜上的受体结合,刺激内皮细胞的分裂、增殖、迁移,促毛细血管绊形成并向瘤体内延伸,使肿瘤内微血管数量增加,满足肿瘤对代谢的需要。研究表明VEGF与NSCLC预后相关[5],但也有不少研究持不同的观点[6]。

本研究旨在从肿瘤细胞学标本检测 MMP-2 VEGF在经临床病史、影像学及细胞病理证实为肺癌的石蜡细胞学切片的表达情况来探讨二者表达之间的相关性,并进一步探讨MMP-2、VEGF在肺癌侵袭转移过程中发挥的作用。

材料和方法

1.临床资料

收集了2008年1月至2010年1月中国医科大学附属第一医院病理科经液基薄层细胞学检查(Thin-layer cytology test,TCT)筛查出诊断为腺癌细胞、异型增生细胞及增生上皮细胞并做过石蜡包埋细胞学标本264例。经临床病史、影像学及细胞病理学诊断为肺腺癌的病例207例:其中胸水石蜡细胞学标本138例、痰石蜡细胞学标本69例;另有对照57例:其中包括胸水异型增生上皮石蜡标本36例、增生上皮21例。所有病例均未经过放化疗,男144例,女120例,年龄29岁-82岁,平均年龄57岁。

2.主要实验药品(美国Bio Genex公司)兔抗人VEGF单克隆抗体(即用型),鼠抗人MMP-2单克隆抗体(即用型),兔抗人 TTF-1单克隆抗体(即用型),鼠抗人 CK19单克隆抗体(即用型),S-P免疫组化试剂盒。

3.实验方法 胸水、痰液标本常规离心、沉淀包埋、切片、脱蜡、水化,免疫细胞化学方法按S-P法常规步骤进行,以PBS代替一抗作阴性对照。

4.结果判定免疫细胞化学染色结果镜下细胞胞浆或胞膜有棕黄色颗粒为阳性染色,细胞浆呈透明或无色者为阴性,切片中观察5个高倍视野(× 200),每一视野计数100个细胞,阳性染色细胞<5%为阴性,≥5%为阳性。

5.统计学分析

应用SPSS16.0版软件包,计数资料比较采用卡方检验,等级相关性采用 Spearman相关分析, P<0.05为有统计学意义。

结 果

1.实验所选取肿瘤细胞标本均为肺腺癌细胞

通过TCT检查,筛选出胸水、痰中查到肿瘤细胞的标本(图1.A、B),做进一步石蜡细胞包埋切片(图 1.C、D),免疫细胞化学 TTF-1、CK19染色证实了这些脱落肿瘤细胞的来源及分型(图1.E、F、G、H)。因此选取的肿瘤细胞标本均为肺腺癌细胞。

2.MMP-2在肺腺癌细胞学标本中的表达情况

264 例石蜡细胞学标本中MMP-2的表达情况为胸水腺癌细胞阳性率为71.7%(99/138)、不能确定的肺腺癌细胞或可疑肺腺癌细胞阳性率16.7%(6/36)、良性增生上皮细胞不表达(0/ 21)、痰中腺癌细胞阳性率39.1%(27/69),阳性染色主要定位于胞浆(图 2),统计结果显示, MMP-2在胸水腺癌细胞中的阳性表达率明显高于在异型增生上皮、增生上皮及痰腺癌细胞中的表达率(P均<0.05)(表1)。

表1 MMP-2在肺腺癌细胞学标本中的表达Table 1 The expression of MMP-2 in cytological specimen of lung cancer

3.VEGF在肺腺癌细胞学标本中的表达情况

264 例石蜡细胞学标本中VEGF的表达情况为胸水腺癌细胞阳性率为89.1%(123/138)、异型增生上皮细胞阳性率33.3(12/36)、增生上皮细胞不表达(0/21)、痰中腺癌细胞阳性率47.8%(33/69),阳性染色主要定位于胞浆和胞膜(图3),统计结果显示,VEGF在胸水腺癌细胞中的阳性表达率明显高于在异型增生上皮、增生上皮及痰腺癌细胞中的表达率(P均<0.05)(表2)。

表2 VEGF在肺癌细胞学标本中的表达Table 2 The expression of VEGF in cytological specimen of lung cancer

4.MMP-2及VEGF的关系

MMP-2和VEGF在264例石蜡细胞学标本中总的阳性率分别为 56.8%(150/264)、63.6%(168/264)二者阳性表达率之间成正相关(r= 0.867,P=0.049)(表3)。

表3 MMP-2和VEGF表达之间的关系Table 3 The relationship between MMP-2 and VEGF expressions

讨 论

目前肺癌已成为全球发生率最高的恶性肿瘤之一。在北美,肺癌的死亡率居各大肿瘤之首,甚至超过乳腺癌、结肠癌和前列腺癌死亡率的总和。在我国,肺癌的发病率死亡率也迅速上升[7],而肺癌的浸润转移和耐药性的产生是导致死亡率上升的主要原因。

肿瘤的浸润和转移是肿瘤细胞与肿瘤基质成分共同参与的过程。转移的过程虽然很复杂,但其中的基本步骤是癌细胞对细胞外基质(Extra cellular matrix,ECM)和血管基膜的降解和破坏。肿瘤细胞能够分泌组织蛋白酶、胶原酶、粘蛋白酶等多种水解酶,其中Ⅳ型胶原酶作为专一性降解基膜的酶越来越受到关注。Ⅳ型胶原纤维是ECM和基膜的重要组分之一,而MMP-2能有效地将其降解,进而导致肿瘤细胞的浸润侵袭。

肿瘤血管生成在肿瘤的生长、侵袭、转移中起着重要作用,血管内皮生长因子能刺激血管内皮细胞生长和增殖,是多种肿瘤血管生长因子的重要组分[8],并通过促进肿瘤血管生成,增加血管通透性和下调宿主抗肿瘤免疫应答等机制,参与实体瘤的发生与发展[9-10],大量研究表明人类肿瘤细胞普遍存在VEGF高表达[11]。

我们将收集的所有标本分成了三类:胸水中的脱落肿瘤细胞标本、痰液标本、显微镜下不能确定肺腺癌细胞的异型增生的上皮细胞。恶性胸腔积液作为肿瘤的一种中晚期行为,脱落细胞多来自于肺癌转移,我们将其作为转移的阳性组;痰脱落细胞学检查是诊断早期肺癌的一个重要手段[12],我们将其中的肺腺癌细胞标本作为阳性对照组;胸腔积液脱落的异型增生及增生细胞作为阴性组。在我们的病例中观察到VEGF MMP-2在肺癌形成的恶性胸水肿瘤细胞中高表达,而在痰检阳性的肿瘤细胞中表达率较低,在异型增生上皮及增生上皮中低表达或者无表达,前者与后三者比较起来有统计学意义,但对异型增生的细胞应提出定期随访观念,以期提高早诊率。吕传剑等[13]研究表明VEGF在有淋巴结转移及胸膜侵犯者明显高于无淋巴结转移和无胸膜侵犯者,提示VEGF可能是肺癌侵袭和转移的促进因子。林尤恩等[14]也报导了VEGF阳性表达与肿瘤的TNM分期及淋巴结转移有关,而与肺癌的组织学类型无关[15]。同样有研究表明[16]MMP-2的表达率与肺癌TNM分期及淋巴结转移有关,且与乳腺癌、胃癌、膀胱癌的预后较差有密切关系[17]。这都与本研究的结果相一致。

关于MMP-2和VEGF在肺癌侵袭转移过程中作用的文献报导很多,但是至今尚未有从细胞学角度阐述二者之间相互关系的报导,本研究直接对比痰液中癌细胞标本与胸水中癌细胞 MMP-2和VEGF的表达情况,直观地说明了胸水中癌细胞的MMP-2和 VEGF表达率要高,进一步说明了MMP-2和VEGF在肺癌的侵袭转移过程中发挥了重要作用。本研究中还发现MMP-2和VEGF的阳性表达率之间成正相关,说明二者在促进肺癌的侵袭转移过程中起到了一个协同作用,进一步验证了MMP-2在肿瘤的血管化中发挥重要作用[2]。利用免疫细胞化学方法进行VEGF和MMP-2的联合染色可以提高早期诊断及胸水中肺腺癌细胞的鉴别诊断。

[1]Chamber AF,Matrisian LM.Changing views of matrix metalloproteinase in metastasis.Natl Cancer Inst,1997, 89:1260-1265

[2]Person SL,Watson SA,Brown PD,et al.Matrix metalloproteinase.Br J Surg,1997,84:160-166

[3]Thomas P,Khokha R,Shepherd FA,et al.Differential expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in non-small cell lung cancer.Pathol,2000,190(2):150-156

[4]Delebecq TJ,Porte H,Zerimech F,et al.Overexpression level of Stromelysin 3 is related to the lymph nodeinvolvement in non-small cell lung cancer.Clin Cancer Res,2000,6(3):1086-1092

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[13]吕传剑,万娅敏,陈学军,等.VEGF在周围型肺癌癌组织中的表达及意义。山东医药,2009,49(3): 57-59

[14]林尤恩,刘祖宏,蔡伟明.VEGF在非小细胞肺癌中的表达及临床意义。肿瘤学杂志,2009,15(3): 521-522

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[16]赵忠升,张梅,茹国庆.MMP-2和MMP-9在非小细胞肺癌中的表达及预后意义。中国肺癌杂志,2000, 3(2):107-110

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EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF MMP-2 AND VEGF INLUNG ADENOCARCINOMA CELLS

Fang Changqing,Guo Xiaoning,Li Miao1,Li Changsi2,Li Jianhua＊
(Department ofPathology,College of B asic Medical Sciences,China Medical University,and Department ofPathology,The First A f f iliated Hospital of China Medical University,S hengyang 110001;1Department ofPathology,The Second A f f iliated Hospital,Liaoning Traditional Chinese Medical University,S hengyang110034;2The First A f f iliated Hospital of China Medical University,S hengyang110001,China)

Objective To investigate the expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and vascular endothelial growth factor(VEGF)in pleural effusion and sputum cytological specimens of lung adenocarcinoma and their role during invasion and metastasis.Methods The expressions of MMP-2 and VEGF in 264 cases of paraffin specimens from pleural effusion and sputum were detected by immuncytochemistry.Results The positive rate of MMP-2 was 71.7%in adenocarcinoma cells of pleural effusion, 16.7%in atypical hyperplasia cells and 39.1%in adenocarcinoma cells of sputum;it showed no expression in hyperplastic epithelial cells from benign pleural effusion.The positive rate of MMP-2 in tumor cells of malignant pleural effusion was significantly higher than that in atypical hyperplastic cells or hyperplastic epithelial cells of the pleural effusion and adenocarcinoma cell in sputum(P<0.05).The incidence of VEGF expression was 89.1%in pleural effusion adenocarcinoma cells,33.3%in atypical hyperplasia cells compared to 47.8%in adenocarcinoma cells of sputum;it showed no expression in hyperplastic epithelial cells of benign pleural effusion.The positive rate of VEGF in tumor cells of malignant pleural effusion was significantly higher than that in atypical hyperplastic cells,hyperplastic epithelial cells of the pleural effusion and tumor cell in sputum(P<0.05).Moreover,the positive rates of MMP-2 and VEGF had a positive correlation(r=0.867,P=0.049).Conclusion The high expressions of MMP-2 and VEGF in tumor cells from pleuraleffusion of lung cancer may have a relationship with tumorinvasion andmetastasis.Moreover,the unity of MMP-2 and VEGF immunocytochemistry is helpful for pathological diagnosis of adenocarcinoma cells of lung cancer.

MMP-2;VEGF;Lung adenocarcinoma cell

R743.2

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.013

2010-03-16

2010-05-20

辽宁省科学技术厅(20082077)

方长清,男(1968年),汉族,主管技师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)