FISH和IHC检测HER2基因及蛋白在乳腺癌诊治中的应用

2010-09-12郭华雄邓明凤陈登峰张柳袁璐刘静杨勇徐正丰王昌富

中国组织化学与细胞化学杂志 2010年4期

关键词：阴性病例乳腺癌

郭华雄邓明凤陈登峰张柳袁璐刘静杨勇徐正丰王昌富＊

(华中科技大学同济医学院附属荆州医院1病理科,2中心实验室,3乳腺科荆州434020)

FISH和IHC检测HER2基因及蛋白在乳腺癌诊治中的应用

郭华雄1邓明凤2陈登峰3张柳1袁璐1刘静1杨勇1徐正丰3王昌富2＊

(华中科技大学同济医学院附属荆州医院1病理科,2中心实验室,3乳腺科荆州434020)

目的对比研究免疫组织化学(IHC)与荧光原位杂交(FISH)方法检测乳腺癌中C-erbB-2蛋白表达和HER2基因扩增,评估两种方法的实际应用价值。方法 IHC和FISH法分别检测58例乳腺癌组织中C-erbB-2蛋白表达和HER2基因扩增状况,并进行一致性分析。结果 IHC检测蛋白阳性2+和3+共22例,占总病例的37.9%,58例乳腺癌中FISH检测出HER2基因扩增17例,占29.3%。IHC检测C-erbB-2蛋白3+的12例中11例HER2基因扩增阳性,1例无扩增;C-erbB-2蛋白2+者10例,其中5例可见HER2基因扩增;C-erbB-2蛋白1+者11例HER2基因扩增仅1例。C-erbB-2蛋白阴性病例共25例均未检测到基因扩增。结果显示IHC检测C-erbB-2蛋白与FISH检测 HER2基因扩增状态有较高的一致性(k=0.681,P<0.01),C-erbB-2蛋白阴性和3+标本与HER2基因扩增阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05);而C-erbB-2蛋白1+和2+病例与其 HER2基因扩增差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 IHC检测C-erbB-2蛋白强阳性(3+)和阴性(0)与 HER2基因扩增有较高的一致性,可作为临床是否应用 Herceptin治疗的依据,而C-erbB-2蛋白2+和1+病例必须进一步行HER2基因扩增检测。

乳腺癌;HER2基因;蛋白;荧光原位杂交;免疫组织化学

原癌基因 HER2的蛋白表达产物是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白(p185),属表皮生长因子受体家族成员,通过细胞间的信号传导,调节细胞的增殖、分化和生长。目前研究表明,在乳腺癌中约有25%-30%的病例有HER2基因的扩增和蛋白的过度表达[1,2],HER2阳性乳腺癌患者的复发及转移率高、预后不良,且常规化疗效果不佳,而针对HER2阳性的分子靶向抗体赫赛汀(Herceptin)对乳腺癌有很好的疗效,因此 HER2的检测广泛受到临床和病理医师的重视。目前常用的检测方法有IHC和 FISH,但由于IHC检测C-cerB-2阳性也并非代表的 HER2基因扩增[3],我们应用IHC和 FISH检测乳腺癌中的 C-erbB-2蛋白及HER2基因表达状况,分析二者之间一致性及实际应用价值,为乳腺癌的诊断与治疗提供可靠依据。

材料和方法

1.材料:

58例乳腺癌为本院病理科2008年1月-2008年9月的活检和手术切除标本,其中浸润性导管癌54例,浸润性小叶癌4例;所有病例均未行术前新辅助化疗。

2.方法

2.1 制片:标本离体后立即固定于10%的中性福尔马林中,固定时间8-24h,常规脱水包埋,以4μm厚度连续切片3张分别用于 HE染色、IHC和FISH检测。

2.2 免疫组织化学(IHC):C-erbB-2一抗为即用型单克隆抗体(Lab Vision产品),MaxVisionTM快速法试剂盒购自迈新生物技术开发有限公司。常规切片、脱蜡入纯水。组织切片放入p H6.0的柠檬酸缓冲液中,微波抗原修复,用PBS(p H7.4)洗片后入3%甲醇 H2O210min,充分洗涤后加入一抗4℃冰箱过夜,PBS充分洗片,切片滴加即用型 MaxVisionTM试剂,室温孵育15min,洗涤后加DAB显色液后显微镜下观察信号并终止显色,苏木素衬染,脱水、透明、封固。已知阳性切片作阳性对照,PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

2.3 荧光原位杂交(FISH):GLP HER2/ CSP17探针试剂盒(购自北京金菩嘉医疗科技有限公司)。组织切片室温下脱蜡,水化,酸性亚硫酸钠50℃处理,蛋白酶 K37℃消化,HCl浸泡,-20℃梯度乙醇中脱水,室温浸入丙酮固定,自然干燥玻片。55℃加热玻片5-10min,变性液中浸泡5min,梯度脱水,将10μl变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域。封片后置于预热的湿盒中,42℃保温箱中过夜杂交16h。移去盖玻片,立即将玻片分别置于50%甲酰胺/2×SSC、2×SSC 0.1%NP-40/2×SSC溶液中漂洗,70%乙醇浸泡3min后取出玻片,暗处自然干燥,将15μl DAPI复染剂滴加于杂交区域位置,覆以盖玻片。暗处放置20min后在荧光显微镜下观察杂交信号。

2.4 结果判断:

(1)IHC:参照美国临床肿瘤协会/美国病理学家学院 HER2检测指南评分系统[4]:浸润性肿瘤细胞无着色为阴性(0),瘤细胞呈弱且不完整的胞膜着色或<10%瘤细胞呈较弱的胞膜染色为弱阳性(1+),≥10%瘤细胞有较弱但完整的胞膜着色或≤30%瘤细胞呈强且完整的胞膜着色为阳性(2 +),>30%肿瘤细胞呈较强的完整细胞膜染色为强阳性(3+)。

(2)FISH:在10/40倍物镜下观察信号,选择细胞核大小一致、核的边界完整、DAPI染色均一、细胞核孤立无重叠、绿色着丝粒信号清晰的区域,在100倍物镜下,通过特异的单通道滤光片随机计数30个细胞内信号。正常细胞:单个间期细胞核中红色及绿色信号各2个。HER2基因扩增异常细胞:单个间期细胞核中红色信号大于2个。Ratio值计算:Ratio值=30个细胞核中核中红色信号总数/30个细胞核中绿色信号总数,Ratio<1.8提示该样本无 HER2基因扩增;Ratio>2.2提示样本中 HER2基因扩增,若两种信号的比值>20或众多信号连接成簇时,可不用计算,即视为基因扩增;Ratio在1.8-2.2之间时,可以选择增加计数细胞至100个,或者重新本次实验来判断最终结果。

3.统计学分析

应用SPSS13.0统计软件,FISH和ICH检测方法采用kappa一致性检验分析;HER基因扩增与C-erbB-2蛋白表达阴/阳性率比较采用X2检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1.乳腺癌中HER2基因扩增及蛋白表达

C-erbB-2蛋白阳性信号位于细胞膜,HER2基因扩增为细胞核内红色信号大于2个(图1-4)。58例乳腺癌中 FISH检测出 HER2基因扩增17例,占29.3%,IHC检测 HER2蛋白有阳性信号者33例,占56.9%,其中阳性2+和3+共22例,占总病例的37.9%,C-erbB-2蛋白检出率明显高于HER2基因扩增。

2.HER2基因扩增与蛋白表达的相关性,见表1

本组IHC检测C-erbB-2蛋白3+的12例中11例HER2基因扩增阳性,1例无扩增,C-erbB-2蛋白2+者10例,其中5例可见基因扩增,HER2蛋白1+者11例HER2基因扩增仅1例,C-erbB-2蛋白阴性病例共25例均未检测到基因扩增。本组结果显示IHC检测C-erbB-2蛋白与FISH检测HER2基因扩增状态有较高的一致性且具有统计学意义(k=0.681,P=0.000);其中C-erbB-2蛋白阴性和3+病例与HER2基因扩增阴性和阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05);而C-erbB-2蛋白1+和2+病例与 HER2基因是否扩增(阴/阳性率比较)差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 乳腺癌HER2/neu基因扩增与C-erbB-2蛋白表达的相关性Table 1 The correlation of Her-2 gene amplification and C-erbB2 protein in breast cancer

讨论

乳腺癌组织中有无 HER2基因扩增和蛋白过度表达,对于判断患者的预后、预测临床疗效以及选择使用赫赛汀生物靶向治疗有重要意义,因此准确检测HER2基因和蛋白状况极为关键。

在多种检测手段中,以IHC和FISH应用较多,FISH检测目的物为相对稳定的DNA,检测过程较少受人为因素的影响,判读标准客观,可操作性强,特异性高,是检测 HER2基因扩增的金标准[5],但因价格昂贵,且对实验设备要求高,一般实验室难以开展。而 IHC检测物为CerbB-2蛋白,其特异性低于 FISH法,但却有较高的敏感性,由于IHC方法固有的特点及制片效果、判读因素使不同医院间的结果差异较大。因此现在较多研究者认为对于IHC检查C-erbB-2蛋白阳性患者均应行FISH复查[6,7]。本研究将IHC和 FISH方法进行对比分析,希望寻找到最合理的复查模式。

本组58例乳腺癌中有 HER2基因扩增者17例,检出率为29.3%,我们的IHC和FISH实验分别在两个独立实验室完成,在各自实验结束后才进行结果比对,在蛋白表达为0和3+的病例,其与FISH检测结果的符合率分别达到了 100%(25/25)和91.7%(11/12),与国内外研究结果一致[8,9]。在C-erbB-2蛋白3+者12例中仅1例未发现相应的基因扩增,占无扩展病例的2.4%(1/ 41),在推测本例可能出现IHC结果假阳性时,也不能排除FISH实验中偶尔产生的误差情况。实验表明这两组病例IHC和FISH结果具有较高的一致性和吻合性(k=0.681,P<0.01),因此我们认为只要前期组织处理得当,IHC实验严格质量控制,对于IHC检测C-erbB-2蛋白阴性标本无需再做FISH检测;而 IHC检测C-erbB-2蛋白3+病例出现假阳性率极低,出于卫生经济学的观点,一般情况下不必强调增做FISH检查。

事实上IHC与FISH实验结果对比主要集中在C-erbB-2蛋白表达1+和2+的病例,我们的这两组病例C-erbB-2蛋白表达与 HER2基因扩增阳性率比较差异具有统计学意义(P<0.05),其结果的一致性和吻合性都存在明显的差异,特别是2 +病例组的误差达到了50%(5/10),与国内文献报道C-erbB-2蛋白2+病例FISH阳性率为25%-76.19%结果一致[9,10]。因此我们认为这类病人必须增做FISH检查(尤其是C-erbB-2蛋白表达2+的病例),以获得准确的HER2状况。

基于IHC和FISH法各自的特点,在乳腺癌病理诊断实际应用中将两者结合,IHC作为主要的检测手段,对于蛋白表达阴性或阳性3+者可直接报告临床,作为 Herceptin分子靶向治疗的依据,而对于蛋白表达1+和2+病例(特别是2+者)应进一步行FISH检查,以明确是否有HER2基因扩增,为临床判断预后和选择治疗提供科学依据。

[1]Kasof G M,Comes B C.Livin,a novel inhibitor of apoptosis protein family member.J Biol Chem,2001,276(2):3238-3246

[2]Shin S J,Hyjek E,Early E,et al.Intratumoral heterogeneity of her-2/neu in invasive mammary carcinomas using flu oreseence in situ hybridization and tissue microarray.Int J Surg Pathol,2006,14:279-284

[3]Hammock L,Lewis M,Phillips C,et al.Strong Her-2/neu protein overexpression by immunohistochemistry often does not predict oncogene amplification by fluorescence in situ hybridization.Hum Pathol,2005,36: 1043-1047

[4]Wolff AC,Hammond ME,Schwartz JN,et al.American Society of Clinical Oneology/College of American Pathologists guideline recommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 testing in breast cancer.Arch Pathol Lab Med,2007,131(1):18-43

[5]刘彤华.表皮生长因子受体家族与靶向性抗癌治疗.中华病理学杂志,2006,35(7):577-579

[6]王跃华,王全红,李丽,等.乳腺癌 Her一2基因检测方法对比研究.临床与实验病理学杂志,2007,32(2):225-226

[7]连婧,王全红,李丽,等.IHC、FISH与CISH检测乳腺癌HER2基因状态的对比研究.肿瘤研究与临床, 2008,20(12):816-819

[8]俞巍,谷俊朝,徐秀红,等.荧光原位杂交法检测乳腺癌HER-2/neu表达及临床意义.首都医科大学学报,2009,30(1):93-96

[9]Press M F,Sauter G,Bernstein L,et al.Diagnostic evaluation of HER-2 as a molecular target:an assessment of accuracy and reproducibility of laboratory testing in large,prospective,randomized clinicaltrials.Clin Cancer Res,2005,11:6598-6607

[10]王晓兰,姚凡,刘楠,等.FISH在乳腺癌组织 HER2/ neu原癌基因检测上的应用及其临床意义的研究.中国医科大学学报,2008,37(5):664-666

[11]曾瑄,梁智勇,武砂裴,等.乳腺癌 HER2蛋白表达阳性者的基因状态分析.中华病理学杂志,2006,35(10)584-588

图版说明

图1 C-erbB-2蛋白1+,瘤细胞不完整的胞膜着色,IHC

SP法 ×400

图2 C-erbB-2蛋白2+,<30%瘤细胞呈强且完整的胞膜着色,IHC SP法 ×400

图3 C-erbB-2蛋白3+,多数瘤细胞呈强而完整的胞膜着色,IHC SP法 ×400

图4 HER2基因扩增,瘤细胞核内红色信号 >2个, FISH法 ×1000

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Expression of C-erbB2 protein is positive.there is no tintegrity staining in the cell membrane.IHC S-P method×400

Fig.2 Expression of C-erbB2 protein is moderately positive.There are strong and integrity staining in the cell membrane,but less than 30%.IHC S-P method ×400

Fig.3 Expression of C-erbB2 protein is strongly positive.There are strong and integrity staining of cell membrane.IHC S-P method×400

Fig.4 Her-2 gene amplication,the number of red signal in nucleus is more than two.FISH method×1000

DETECTIONOF HER-2 GENE BY FISHAN D IHC INDIAGN OSIS AN D TREATMENT OF BREST CANCER

Guo Huaxiong1,Deng Mingfeng2,Chen Dengfeng3,Zhang Liu1,Yuan Lu1,Liu Jing1, Yang Yong1,Xu Zhengfeng3,Wang Changfu2＊
(1Department of Pathology,2The Centre of laboratory,3Department of Breast,Institute of Jingzhou Hospital of Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Jingzhou434020,China)

Objective To compare the clinical significance between detecting C-erbB2 protein expression by immunohistochemistry(IHC)and detecting Her-2 gene amplification by flurescence in situ hybridization(FISH)in breast cancer.Methods The expression of C-erbB2 protein and Her-2 gene amplification in 58 cases of breast cancer were detected by IHC and FISH respectively,and the concordance between them was analyzed.Results Of 58 cases,the expression of C-erbB2 protein was strongly and moderately positive in 22 cases(37.9%),and the Her-2 gene amplification existed in 17 cases(29.3%).In 12 cases where the expression of C-erbB2 protein was strongly positive by IHC,Her-2 gene amplification exsited in 11 cases.In 10 cases where the expression of C-erbB2 was moderately positive,Her-2 gene amplification exsited in 5 cases.In 11 C-erbB2 weakly positive cases,Her-2 gene amplication exsited in only 1 case.But in 25 C-erbB2 negative cases,none was amplied.Those data showed good concordance between the two methods,(κ=0.681,P<0.01).In addition,for the cases with strongly positive or negative expression, the difference between IHC and FISH was not statistically significant(P>0.05),but for the cases with moderately and weakly positive expression,the difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion There is favourable concordance between Her-2 gene amplification and strongly positive or negative c-erB2 expression.It can be a evidence to decide whether use herceptin in clinical therapy or not.But for the moderately and weakly positive cases,FISH must be applied.

Breast cancer;Her-2/neu;Protein;FISH;IHC