正交试验法优选肺热清解口服液的提取工艺

刘佩沂 赖岳晓 田素英 刘永红

1.广东中山市黄圃人民医院，广东 中山 528429；2.广东药学院，广东 中山 528458

正交试验法优选肺热清解口服液的提取工艺

刘佩沂1赖岳晓1田素英2刘永红2

1.广东中山市黄圃人民医院，广东 中山 528429；2.广东药学院，广东 中山 528458

目的：优选肺热清解口服液的提取工艺。方法：以总黄酮含量为考察指标，采用正交试验法，考察加水量、提取时间、提取温度、醇沉浓度4个因素对提取工艺的影响。结果：最佳提取工艺为A3B1C1D2，即药材加水10倍，提取时间1个小时，提取温度80℃，醇沉浓度为70%。结论：正交试验法优选肺热清解口服液的提取工艺简便、快速、准确。

正交试验法；优选；肺热清解口服液；提取工艺

肺热清解口服液（制剂批准文号：粤中卫药制剂[98]第4163号）处方来源于中山市黄圃医院临床验方，由竹黄、川贝母、桑白皮、芦根、野菊花、地龙干、车前子、冬瓜仁、瓜蒌皮等十味中药组成，具有清热宣肺、止咳平喘之功效。主治肺热咳嗽，对于急性支气管炎及肺部感染疗效显著。为进一步将此方研制成为质量稳定、疗效显著、服用携带方便的现代中药复方制剂，本研究是以药液中总黄酮含量作为试验指标，根据方中各药味有效成分的理化性质，采用正交试验对肺热清解口服液中总黄酮的提取工艺进行了优选。

1 材料与仪器

UV1102型紫外/可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司），HWS-26型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司），KQ-500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。芦丁对照品（购买自中国药品生物制品检定所，批号：20070318）；实验所用中药材均购于广州致信中药饮片有限公司，经鉴定均符合《中国药典》2005版一部收载品种有关规定；水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 芦丁对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品10.8mg，置100mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液（每mL含芦丁对照品0.108mg）。

2.2 供试品溶液的制备

本处方中的中药材粉碎后过60目筛，加水，置烧杯中浸泡半小时，水浴，加热，提取2次，过滤，合并滤液，低温浓缩至约80mL，浓缩液，加95%乙醇，调节含醇量，静沉48小时，取上清液回收乙醇，得浓缩液作为供试品溶液。本实验以水为溶媒，加水量、水浴温度、时间、浓缩液中的含醇量均要以提取工艺不同而异，具体见后面考查的因素和水平表。

2.3 测定波长的选择

按中国药典2005版第一部附录中规定方法，对供试品溶液和对照品贮备液稀释液分别在358.5nm波长处测定吸收度用于紫外法。取2.1项下芦丁对照品溶液检测最大吸收波长，对照品芦丁在紫外光区间有二个吸收峰，其中358.5nm处的吸收峰最平缓；鉴于该峰为黄酮类的特征吸收峰，故紫外分光光度法选择358.5nm为测定波长。

2.4 线性关系考察

精密吸收芦丁对照品贮备液0.00mL，0.50mL，1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL，分别置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，以第一瓶做空白在选定的358.5nm处测定吸光度。测得的5个吸光度值分别为0.115、0.234、0.480、0.734和0.968。以浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标，进行一元线性回归，得到回归方程：A=22.583C-0.005，芦丁在0.0054mg·mL～0.0432mg·mL浓度范围内，吸光度与浓度线性关系良好，相关系数为0.9998。

2.5 精密度试验

精密吸取0.108mg·mL芦丁对照品溶液5mL，甲醇定容至50mL，在358.5nm条件下测定吸光度值，连续测定5次，得吸收度平均值为0.233。测定芦丁对照品吸光度值的RSD为0.86%。

2.6 稳定性考察

取药材样品的粗粉，按2.2项下供试品溶液制备方法，制备紫外分光光度法测定的供试液，分别于配置后0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h，依紫外分光光度法测定吸光度，结果表明，供试液的吸光度在6h内不发生变化，RSD=0.65%。2.7 重复性试验

取同一批号的药材样品6份，按“2.2”项下“供试品溶液的制备”后依紫外分光光度法在358.5nm处测定，记录吸光度值，计算总黄酮含量为2.15mg·g，RSD为3.3%。

2.8 加样回收率

精密称取芦丁对照品10.8mg，甲醇定容至100mL，备用。另取9份已知含量的肺热清解口服液供试品溶液，分别精密加入芦丁对照品溶液1mL（0.108mg·mL），按含量测定方法制备，并按标准曲线法测定，由回归方程计算出回收率。得出平均回收率RSD=0.35%。

3 提取工艺的正交试验

3.1 正交设计

为系统考察提取的工艺参数，根据已有的资料及实际情况，选用加水量（A）、提取时间（B）、提取温度（C）、醇沉浓度（D）作为考察因素，以测得的总黄酮含量为考察指标，选用L9（34）正交表设计[1]。因素水平详见表1。

表1 正交因素水平表

3.2 实验方法及实验数据

取竹黄、川贝母、桑白皮、芦根、野菊花、地龙干、车前子、冬瓜仁、瓜蒌皮、甘草十味药材，粉碎，按处方调配9份样品，按表5设计的工艺条件进行水浴提取，依供试品的制备方法得到供试品溶液，按含量测定方法进行含量测定，依照回归方程计算出总黄酮含量。

3.3 正交试验结果及方差分析

按上述实验方法及实验数据进行正交试验得到9份供试品溶液，按紫外分光光度法，以芦丁为对照品，测定并计算出供试品溶液的总黄酮含量，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

以总黄酮为考察指标，比较表6中各因素的极差R，可以认为各因素对提取总黄酮类化合物的影响大小顺序为A＞C＞B＞D，因素A的极差最大，D的最小，再从各因素水平来看（K值分析），对于总黄酮含量的影响来看，A因素为K3＞K2＞K1，B因素为K1＞K2＞K3，C因素为K1＞K3＞K2，D因素为K2＞K1＞K3，根据以上直观分析结果，肺热清解口服液的水提工艺条件以A3B1C1D2为宜，即以加水量为10倍，提取时间为1小时，提取温度80℃，含醇量为70%为最佳提取条件。为考虑到实际生产的效率和成本，所以有必要对各因素下水平的显著性进行方差分析，结果见表3。方差分析结果表明，因素A（加水量）、B（提取时间）和C（提取温度）的影响具有显著性差异，D（含醇量）的影响没有显著性差异。

表2 肺热清解口服液提取条件正交设计与结果表（总黄酮）

表3 总黄酮含量方差分析结果

3.4 优选工艺的验证试验

按优选的工艺进行验证试验，测得总黄酮的含量分别为2.22mg·mL、2.17mg·mL、2.22mg·mL，RSD为1.33%，测得值均优于正交表中的试验结果，认为验证结果较为满意，表明该工艺稳定可行。因此，确认肺热清解口服液的水提醇沉最佳工艺条件为：加10倍水，提取时间1小时，提取温度为80℃，含醇量为70%。

4 讨论

在肺热清解口服液的处方中，桑白皮为主药，有效成分主要为黄酮类化合物，处方中还有其它组成也含有黄酮，故选择总黄酮作为考查指标。根据黄酮的理化性质，黄酮的极性较大，易溶于水、甲醇、乙醇等溶剂，从考虑经济和安全、环保因素考虑，选用水作为溶剂；处方中，芦根主要有效成分为多糖类，瓜蒌皮的总氨基酸有良好的祛痰效果，竹黄中具有抗菌作用的竹黄菌甲素、乙素，工艺中采取先水提再醇沉得方法可将有效成分充分保留，且提取之前应进行粗粉碎，以利于有效成分的溶出。

提取方法的选择：研究加水量、提取时间、提取温度及含醇量等因素对肺热清解口服液黄酮提取工艺的影响，结合正交试验设计，得到肺热清解口服液中黄酮的最佳提取条件，即以加水量为10倍，提取时间为1小时，提取温度80℃，含醇量为70%，吸光度值较稳定以水浴加热提取2次，合并浓缩滤液制得。

黄酮类化合物含量测定方法有比色法，紫外分光光度法等。采用硝酸铝（氯化铝）比色法来测定芦丁的含量，黄酮类化合物包含许多物质，其在紫外区间的吸光度并不一样，加入显色剂，在碱性条件下，利用其与黄酮形成红色螯合物，在510nm形成新的吸收峰，从而得到待测物质的黄酮含量，但该法的测定易受杂质干扰，定量误差大[2，3]，本文尝试采用紫外分光光度法测定芦丁的含量，直接测定法是依据黄酮自身结构的特点，不使用显色剂，直接在I带的最大吸收波长358.5nm作为紫外分光光度法的测定波长特征吸收峰处对供试样进行测定，从而能够避免复方中萜类化合物酚羟基的干扰，黄酮类为肺热清解口服液中重要的活性物质，该方法简单、快速、准确、重现性好，可用于控制肺热清解口服液的质量。

[1] 陆彬，吴伟.中心多点等距设计优化醋酸地塞米松聚丙交酯微球的制备工艺[J].药学学报，1999；34（5）：387.

[2] 邓胜国，邓泽元，范亚苇.紫外分光光度法测定荷叶总黄酮含量[J].南昌大学学报（理科版），2008，2（32）：148-150.

[3] 邓斌，蒋刚彪，黄红英，等.分光光度法测定夏枯草中总黄酮含量[J].时珍国医国药，2008，7（19）：1608-1609.

R283.3

A

1007-8517（2010）08-054-2

本论文研究内容来源于中山市卫生局科研项目，项目编号为：2009078。

刘佩沂，主管中药师，研究方向：中药学。

田素英，副教授，硕士，研究方向：中药的应用及开发。