正交试验法优选葛连口服液的提取工艺*

杨 波，陈淑映，蔡丽云，刘东文

（广东省佛山市中医院，广东 佛山 528000）

正交试验法优选葛连口服液的提取工艺*

杨 波，陈淑映，蔡丽云，刘东文

（广东省佛山市中医院，广东 佛山 528000）

目的 优选葛连口服液的最佳提取工艺。方法 以君药葛根中葛根素和臣药黄连中盐酸小檗碱含量为考察指标，用正交试验法优选水提工艺的加水量、提取时间和精制方法。结果 确定的最佳水提条件为用9倍量水煎煮2次，每次1 h，药液加3%的硅藻土作为沉淀剂。结论 正交试验优选出的葛连口服液提取工艺简便、合理，适合于工业生产。

葛连口服液；高效液相色谱法；正交试验；葛根素；盐酸小檗碱

Abstract：Objective To optimize the extraction technology of Gelian Oral Liquid.Methods Based on the content of puerarin in Pueraria lobata and the content of berberine hydrochloride in Rhizoma Coptidis，the amount of water，extracting time and refining method were optimized by the orthogonal test.Results The optimum condition of Gelian Oral Liquid for water extraction were 9 times amount of water，decocting twice for 1 h each time，with 3% diatomaceous earth as preciptant.Conclusion The extraction technology optimized by the orthogonal test is simple and reasonable.The optimum condition is available for industrial production.

Key words：Gelian Oral Liquid；HPLC；orthogonal test；puerarin；berberine hydrochloride

葛连颗粒是佛山市中医院内科验方，由葛根、黄连、白头翁、木香等药材组成，具有清热利湿功效，经多年临床验证，对各种急性、慢性肠炎，泄泻腹痛等有很好的疗效，但也存在口感差、制备工序收率低的缺点，故拟将颗粒剂改剂型为口服液。笔者以制剂中葛根素、盐酸小檗碱的含量为考察指标，通过L9（34）正交试验优选葛连口服液的提取工艺，报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪，包括Waters-1525型泵，717进样阀，2996紫外检测器，800工作站；QG45型管式离心机（上海离心机械研究所有限公司）。葛根素对照品、盐酸小檗碱对照品均由中国药品生物制品检定所提供；所用药材均为市售品，经鉴定均为正品；硅藻土；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计

根据影响葛连口服液制备工艺的3个主要因素，即回流时间（因素A）、水用量（因素B）、精制方法（因素C），分别设定3个水平，因素水平见表1。以成品中葛根素、盐酸小檗碱含量为考察指标，用高效液相色谱（HPLC）法测定其含量，按正交表L9（34）进行正交试验，对考察因素综合评分，确定最佳的提取精制工艺。

表1 试验因素水平表

2.2 供试品制备

按处方各药材比例，取处方药材9份，分别按正交表L9（34）进行试验，提取次数为2次，水提液浓缩至相对密度为1.1～1.15（60～80℃）时再精制。其中醇沉法+超滤法为加入等量95%乙醇至含醇量为47.5%，静置24 h，取上清液，以慢速滤纸加0.45!m微孔滤膜减压过滤；高速离心法为药液用纱布过滤后再以12 000 r/min的转速高速离心处理；吸附澄清法+超滤法为药液加入3%的硅藻土后静置24 h，取上清液，用慢速滤纸加0.45!m微孔滤膜减压过滤。最后9个样品全部定容至1 000 mL，得9份供试品。

2.3 盐酸小檗碱含量测定[1]

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Alltima C18柱(250 mm×4.6 mm，5!m)；流动相：乙酸乙酯 -甲酸 -乙醇（15∶3∶2）；检测波长：346nm；流速：1.5 mL/min；柱温：28 ℃ ；进样量：20!L。在此条件下的色谱图见图1。可见，阴性对照无干扰。

2.3.2 溶液制备

精密称取盐酸小檗碱对照品25.00 mg，置25 mL量瓶中，用盐酸-50%乙醇(1∶100)溶液溶解并稀释至刻度，摇匀后作为对照品溶液。精密吸取按各精制工艺制备的浓缩液5 mL，置50 mL量瓶中，加盐酸-50%乙醇(1∶100)溶液至刻度，摇匀，常压过滤，取续滤液，用0.45!m微孔滤膜过滤，得供试品溶液。取不含黄连的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液(1.00 g/L)0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 mL，分别置 10 mL 量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用0.45!m微孔滤膜过滤，分别吸取各对照品溶液20!L进样，测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标、进样量为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=64 736 918 X+6 685 231，r=0.999 6（n=5）。结果表明，盐酸小檗碱进样量在0.05～0.6 g/L范围内与峰面积积分值线性关系良好。

图1 盐酸小檗碱含量测定高效液相色谱图

精密度试验：取同一盐酸小檗碱对照品溶液，依法重复进样5次。结果峰面积积分值的 RSD=0.93%（n=5），表明仪器精密度较好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于 0，2，4，6，8 h时依法测定。结果峰面积积分值的 RSD=0.74%（n=5)，表明供试品溶液在8 h内稳定性较好。

重现性试验：取用最佳提取工艺制备的样品，依法制备供试品溶液并进样分析。结果盐酸小檗碱峰面积的 RSD为1.1%（n=5），表明方法重现性较好。

加样回收试验：精密吸取5 mL已知含量的样品，置25 mL量瓶中，加适量盐酸小檗碱对照品，按供试品溶液制备方法制备溶液并依法测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=6)

2.3.4 样品含量测定

取样品，依法制备供试品溶液，吸取20$L注入液相色谱仪，测定并计算盐酸小檗碱含量。结果见表2。

表2 正交试验结果

2.4 葛根素含量测定[1-2]

2.4.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Alltima C18柱 (250 mm×4.6 mm，5$m)；流动相：甲醇 -水（25 ∶75）；检测波长：250 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：28 ℃ ；进样量：20$L。在此条件下的色谱图见图2，可见阴性对照无干扰。

2.4.2 溶液制备

精密称取葛根素对照品2.30 mg，置25 mL量瓶中，用30%的乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀后作为对照品溶液。精密吸取按各精制工艺制备的浓缩液5 mL，置25 mL量瓶中，用30%的乙醇定容至刻度，摇匀，以0.45$m微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。取不含葛根的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。

“数学教育中的历史与认识论欧洲暑期大学”中的“认识论”主要是指（2）中的“历史认识论”，尤其强调数学知识建构中的问题、错误、猜想及“认识论断裂”这个概念的作用．

2.4.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取对照品溶液(0.092 g/L)2，4，6，8，10$L，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积积分值 Y对对照品溶液质量浓度 X进行回归分析，得回归方程 Y=4 052 382 X-87 617，r=0.999 8（ n=5）。结 果表明，葛根素质量浓度在0.184～0.920 g/L范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验：取同一葛根素对照品溶液，依法重复进样5次。结果峰面积积分值的 RSD=1.02%（n=5），表明仪器精密度较好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别在 0，3，6，9，12 h 时依法测定。结果峰面积积分值的 RSD=0.89%（n=5），表明供试品溶液在12 h内稳定性较好。

重现性试验：取同一样品，依法制备供试品溶液并测定。结果葛根素峰面积的 RSD=1.2%(n=5)，表明方法重现性较好。

加样回收试验：精密吸取5 mL已知含量的样品，置25 mL量瓶中，加适量葛根素对照品，按供试品溶液制备方法制备溶液并依法测定含量，计算回收率。结果见表1。

取样品适量，依法制备供试品溶液，吸取20$L，注入液相色谱仪，测定并计算葛根素含量。结果见表2。

2.5 正交试验及结果

结果见表2和表3。由表2综合评分数据的极差大小可看出，各因素作用的大小依次为C＞B＞A。表3结果表明，因素C(精制方法)对提取效果的影响有显著性(P＜0.05)，因素A（回流时间）、因素B（水用量）的影响则无显著性。综合直观分析与方差分析的结果，同时考虑生产的可操作性和节能状况，确定最佳工艺组合为A1B2C3，即加9倍量的水提取2次，每次1 h，合并提取液，浓缩至相对密度为1.10～1.15（60～80℃）时，药液加入3%的硅藻土，静置24 h，取上清液，用慢速滤纸加0.45$m微孔滤膜减压过滤，滤液定容至1 000 mL。

图2 葛根素含量测定高效液相色谱图

表3 方差分析

2.6 验证试验

为验证优选工艺的可靠性和重复性，按最佳工艺平行制备了3份样品，测得盐酸小檗碱的平均含量为0.527 g/L，葛根素的平均含量为0.813 g/L，均高于正交试验9份样品的含量，说明本工艺可靠，适用于工业生产。

3 讨论

多指标优选中药复方提取工艺是提高中药复方制剂质量的一种重要方法，但要得出一个合理的评价标准，就必须针对指标间的重要性差异给出权重，综合评分后再进行分析。对各指标权重的设置，要根据具体情况作具体分析。本处方中的葛根既能清透邪热，又能升发清阳，鼓舞脾胃清阳之气上升而奏止泻止痢之效，属君药；黄连用于胃肠湿热、泻痢身热者，为臣药。因此，葛根素、盐酸小檗碱含量的权重系数分别设为0.5和0.3。采用综合评分的方差分析优选出的提取工艺更具科学性和合理性，对生产有积极的指导意义。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2005：213-214，233-234.

[2]唐丽琴，刘 圣，陈礼明，等.高效液相色谱法测定复方黄连颗粒中葛根素的含量[J]. 中国药房，2003，14（7）：425-427.

Study on Extraction Technology of Gelian Oral Liquid with Orthogonal Test

Yang Bo，Chen Shuying，Cai Liyun，Liu Dongwen
(Foshan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Foshan，Guangdong，China 528000)

TQ461；R286.0

A

1006－4931(2010）11－0032－03

杨波，男，大学本科，副主任药师，研究方向为中药制剂，（电话）0757-82121101（电子信箱）mooneyes73@163.com。

2009－04－23；二次

2009－10－15）

*广东省佛山市卫生局医学科研立项项目，项目编号：2007102。