灵芝颗粒质量标准研究

薛强，李卿，秦剑，肖铭玉（1.重庆医科大学附属第二医院，重庆市 400010；.重庆市中药研究院，重庆市 400065）

灵芝颗粒质量标准研究

薛强1＊，李卿2，秦剑2，肖铭玉2（1.重庆医科大学附属第二医院，重庆市 400010；2.重庆市中药研究院，重庆市 400065）

目的：建立灵芝颗粒的质量标准。方法：采用薄层色谱（TLC）法对方中灵芝、柴胡进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定五味子中五味子甲素、五味子乙素含量。结果：TLC斑点清晰，分离度好，阴性对照无干扰；五味子甲素进样量、五味子乙素进样量分别在0.060～0.60、0.082～0.82µg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系（r分别为0.999 6、0.999 5）；平均回收率分别为99.02%、99.06%，RSD分别为0.45%（n＝6）、0.48%（n＝6）。结论：定性定量方法快速、准确、专属性强，所建标准可用于灵芝颗粒的质量控制。

灵芝颗粒；薄层色谱法；高效液相色谱法；灵芝；柴胡

灵芝颗粒是由灵芝、五味子、柴胡、郁金等4味药材制成的纯中药制剂，具有保护肝脏、降低谷丙转氨酶和退黄作用，用于治疗急性传染性黄疸肝炎、迁延性肝炎、慢性肝炎、单项谷丙转氨酶高等症。为有效监测制剂质量，笔者对该产品的质量标准进行了研究，用薄层色谱（TLC）法对制剂中的灵芝、柴胡进行定性鉴别；采用高效液相色谱（HPLC）法测定五味子中有效成分五味子甲素、五味子乙素的含量。

1 仪器与材料

LC-2010型HPLC仪（日本岛津公司）；二极管阵列紫外检测器（上海顾村电光仪器厂）；AE-240S型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；薄层色谱成像仪（瑞士卡玛公司）。

五味子甲素、五味子乙素、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品，灵芝、柴胡对照药材（中国药品生物制品检定所，批号分别为110764-200107、110765-220205、110857-200405、110778-200404、120968-200203、0992-200102）；灵芝颗粒（重庆市中药研究院自制，批号：091001、091101、091102）；各阴性样品均由重庆市中药研究院中药化学室提供；乙腈为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 灵芝的TLC鉴别

取本品2 g，研细，加乙醇30 mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇3 mL使溶解，作为供试品溶液；另取灵芝对照药材1 g，同法制成对照药材溶液；另取缺灵芝阴性样品2 g，同法制成缺灵芝阴性对照溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述3种溶液各5µL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。灵芝的TLC见图1。

2.2 柴胡的TLC鉴别

取本品3 g，研细，加甲醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；另取柴胡对照药材0.5 g，加甲醇20 mL，同法制成对照药材溶液；再取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品，加甲醇制成每1 mL各含0.3 mg的溶液，作为对照品溶液；另取缺柴胡阴性样品3 g，同法制成缺柴胡阴性对照溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述溶液各10µL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1，饱和10 min）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照无干扰。柴胡的TLC见图2。

图1 灵芝的TLC1.供试品；2.灵芝对照药材；3.缺灵芝阴性对照Fig 1 TLC of Ganoderma1.test sample；2.Ganodermareferencesubstance；3.negative control without Ganoderma

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件及系统适用性试验色谱柱：Symmetry ODS C18（150 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）（梯度洗脱 ：0～8 min，A 的 体 积 分数 为55%；8～22 min，A的体积分数为55%～64%）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25℃；检测波长：254 nm。理论板数按五味子甲素色谱峰计算应不低于3 000，五味子甲素、五味子乙素与相邻峰的分离度＞1.5。色谱见图3。

2.3.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，研细，取约2.0 g，精密称定，置于索氏提取器中，加三氯甲烷60 mL，回流提取4 h，回收三氯甲烷至适量，加硅胶1.5 g，搅拌均匀，干燥，置于硅胶柱（100～200目，1.5 g，内径1 cm）上，用三氯甲烷40 mL洗脱，收集三氯甲烷液，蒸干，残渣用甲醇适量使溶解，加甲醇定容至25 mL，摇匀，过滤，即得。

图2 柴胡的TLC1.供试品；2.柴胡对照药材；3.缺柴胡阴性对照；4.柴胡皂苷a对照品；5.柴胡皂苷d对照品Fig 2 TLC of Bupleuri Radix1.testsample；2.Bupleuri Radix reference substance；3.negative control without Bupleuri Radix；4.saikosaponin a；5.saikosaponin d

图3 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.缺五味子阴性对照；1.五味子甲素；2.五味子乙素Fig 3 HPLC chromatogramsA.mixed control substance；B.test sample；C.negative control without Schisandrae Chinensis；1.deoxyschizandrin；2.γ-Schisandrin

2.3.3 混合对照品溶液的制备 精密称取五味子甲素、五味子乙素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含五味子甲素30µg、五味子乙素41µg的混合溶液，即得。

2.3.4 缺五味子阴性对照溶液的制备 取按处方比例及制备工艺制备的不含五味子的阴性样品，按“2.3.2”项下方法制得缺五味子阴性对照溶液。

2.3.5 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液2、5、10、15、20µL，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。以峰面积积分值（A）为纵坐标，进样量（C，µg）为横坐标，进行线性回归，得五味子甲素、五味子乙素的回归方程分别为A＝1 124 602C－4 955.33（r＝0.999 6）、A＝1 351 247C－5 524.26（r＝0.999 5）。结果表明，五味子甲素、五味子乙素进样量分别在0.060～0.60、0.082～0.82µg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.3.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10µL，按“2.3.1”项下色谱条件重复进样6次，测定峰面积。结果，五味子甲素、五味子乙素的RSD分别为0.66%（n＝6）、0.85%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 精密称取样品1份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.3.1”项下色谱条件分别于0、4、6、10、14 h进样测定。结果，五味子甲素、五味子乙素的RSD分别为0.94%（n＝5）、1.20%（n＝5），表明供试品溶液在14 h内稳定。

2.3.8 重复性试验 精密称取同批样品6份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.3.1”项下色谱条件测定。结果，五味子甲素、五味子乙素的RSD分别为1.10%（n＝6）、0.94%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的同批样品6份，分别精密加入五味子甲素、五味子乙素，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.3.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.3.10 样品含量测定 取各批次灵芝颗粒，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.3.1”项下色谱条件测定。结果，3批（批号：091001、091101、091102）灵芝颗粒中每袋分别含五味子甲素1.26、1.64、1.54 mg，含五味子乙素1.95、2.21、2.14 mg。

3 讨论

对本制剂中灵芝、柴胡进行TLC鉴别研究，均以阴性样品为对照。结果表明，各TLC斑点不受样品中其它成分的干扰，专属性强、重复性好，可作为本制剂质量控制检测指标。

本制剂由多味药材提取制成，故对供试品溶液的提取方法（甲醇超声提取法、甲醇回流提取法、三氯甲烷超声提取法、三氯甲烷回流提取法）进行比较。结果，甲醇提取法干扰较大，三氯甲烷超声提取法含量偏低，而三氯甲烷回流提取法操作简便，含量测定结果比较满意；由于成分复杂，采用硅胶柱除杂，效果明显，杂质量大大减少，提高了色谱柱分离效果。

文献报道[2～5]，五味子成分的分析多采用乙腈-水体系，但分离时间长，效果不理想；笔者经反复考察，采用乙腈-磷酸水溶液梯度洗脱，效果明显。在此条件下，样品分离很好，可用于灵芝颗粒的质量控制。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：229、附录31.

[2]窦志华，丁安伟，施 忠.反相高效液相色谱法测定复方五仁醇胶囊中2组分的含量[J].中国药房，2007，18（3）：198.

[3]宣东平，窦志华，尤蝠仪.高效液相色谱法测定五味子浸膏中五味子醇甲与五味子乙素的含量[J].时珍国医国药，2008，19（3）：555.

[4]张立升，富玉海，吕文军.HPLC法测定保肝胶囊中五味子乙素的含量[J].中国药事，2007，21（6）：424.

Study on Quality Standard of Lingzhi Granules

XUE Qiang（The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China）
LI Qing，QIN Jian，XIAO Ming-yu（Chongqing Academy of Chinese Materia Medica，Chongqing 400065，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard of Lingzhi granules.METHODS：The qualitative identification of Ganoderma and Bupleuri Radix was carried out by TLC.The content of deoxyschizandrin and γ-Schisandrin inSchisandra chinensiswas determined by HPLC.RESULTS：The TLC sports were fairy clear and separated well without interference of negative sample.The linear ranges were 0.060～0.60 µg for deoxyschizandrin（r＝0.999 6），0.082～0.82 µg for γ-Schisandrin（r＝0.999 5），respectively.The average recoveries were 99.02%（RSD＝0.45%，n＝6）and 99.06%（RSD＝0.48%，n＝6）.CONCLUSION：The method is rapid，accurate and specific.It can be used for the quality control of Lingzhi granules.

Lingzhi granules；TLC；HPLC；Ganoderma；Bupleuri Radix

R283.627；R927.1

A

1001-0408（2010）39-3722-03

＊主治医师，博士。研究方向：肝胆胰脾疾病。E-mail：kevin-999999@21cn.com

2010-03-07

2010-08-27）