二溴联苯醚对纤细裸藻的生态遗传毒性效应

张 琼,伍 琴,高香玉,孔志明,李 梅(南京大学环境学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,江苏 南京 210093)

二溴联苯醚对纤细裸藻的生态遗传毒性效应

张 琼,伍 琴,高香玉,孔志明,李 梅*(南京大学环境学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,江苏 南京 210093)

通过检测纤细裸藻生长、抗氧化酶活性和单细胞凝胶电泳(彗星试验)研究了4,4’-二溴联苯醚(BDE-15)对纤细裸藻(Euglena gracilis)的生态遗传毒性效应.结果表明,低浓度BDE-15(3×10-6mg/L)对纤细裸藻的生长无显著影响,高浓度时(3mg/L)具有明显的抑制作用,相比空白抑制率达69.70%;叶绿素a和类胡萝卜素含量在高浓度BDE-15作用下显著上升;谷胱甘肽(GSH)和细胞总蛋白含量则随BDE-15浓度增加明显下降;抗氧化酶系统中超氧化物歧化酶(SOD)活性随BDE-15浓度升高显著下降,具明显的剂量-效应关系,过氧化物酶(POD)活性随BDE-15浓度增加呈上升趋势,最高浓度组(3mg/L)比空白对照提高93.45%,显示BDE-15胁迫可诱导抗氧化酶活性;彗星试验结果显示纤细裸藻细胞DNA损伤程度随BDE-15浓度增加而加重,表明高浓度BDE-15具有潜在致突变性.

4,4’-二溴联苯醚(BDE-15)；纤细裸藻；毒性效应；彗星实验

Abstract：The potential ecogenotoxicities of 4, 4’-dibromodiphenyl ether (BDE-15), one of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) were investigated by detecting its effects on growth, pigment contents, antioxidant enzyme activities and DNA damage in microalgae Euglena gracilis. At lower concentrations (3×10-6mg/L), BDE-15 showed no notable effect on the growth of E. gracilis, while at higher concentration (3mg/L), the growth was restrained to 69.70% compared with the control, meanwhile the content of photosynthetic pigments increased. Glutathione (GSH) and protein contents decreased with the increase of BDE-15 concentration. In addition, there was an obvious decrease and dose-effect relationship in SOD activity with the increase of BDE-15 concentration. At higher concentration (3mg/L), POD activity increased by 93.45% compared with the control, which indicated that BDE-15 could induce the activities of antioxidant enzymes in E. gracilis. The degree of DNA damage observed from the comet assay increased with BDE-15 concentration increasing, which suggested that high dose of BDE-15 may have potential mutagenicity on E. gracilis.

Key words：BDE-15；Euglena gracilis；toxicities；comet assay

多溴联苯醚(PBDEs)是一种重要的溴代阻燃剂,在工业中应用广泛.PBDEs本身,以及以其阻燃的高聚物燃烧及热裂产物中含有有毒、致癌、致畸的多溴代二苯并二(PBDD)和多溴代二苯并呋喃(PBDF),危害极大[1].虽然国外已逐步淘汰对PBDEs的使用,但是PBDEs仍然被广泛用于纺织、家具、建材、交通工具和电子产品中,大约构成产品重量的5%～30%[2].研究发现, PBDEs在废水、废弃物(包括电子废物)、沉积物、野生动物(包括海洋哺乳动物、鱼、鸟和蛋等)、食品和人类(奶、血清和脂肪组织等)[3-6]均有检出.由于PBDEs具有难降解性、环境稳定性、高脂溶性和生物放大作用,能够通过食物链的转移,使处于高位营养级的生物受到毒害,最终导致对人体健康的危害.PBDEs作用的靶器官主要是脂肪组织、神经系统、甲状腺和生殖发育系统[2,7-8]等.

水生毒理学研究中,藻类作为水体的初级生产者,因其个体小、繁殖快、对毒物敏感等特点,成为监测评价水环境质量的重要指标[9-10].而以藻类为研究对象的PBDEs研究工作刚刚起步,其对藻类的毒性效应更是少有报道.

彗星试验因具有快速、敏感、可靠等诸多优点而得到越来越广泛的应用[11],但有关微藻的彗星试验国内外均鲜见报道.Aoyama等[12-13]认为,彗星试验比同样条件下人体淋巴细胞的反应更加明显.特定的酶反应(如抗氧化酶系、乙酰胆碱脂酶、谷胱甘肽转移酶等)可以指示外源化合物的毒性及其作用机理,这也是低剂量化学品生态毒理研究的有效手段之一[14].本研究采用广泛用作水环境监测评价的裸藻属(又称眼虫藻属)藻类纤细裸藻(Euglena gracilis)作为受试生物,选择彗星试验、抗氧化酶(SOD和POD)、谷胱甘肽(GSH)和光合色素作为评价指标,研究在环境中含量较高且具水溶性的4,4′-二溴联苯醚(BDE-15)对藻类的遗传毒性效应.

1 材料与方法

1.1微藻培养

纤细裸藻购自中国科学院水生生物研究所典型培养物保藏委员会淡水藻类藻种库(FACHB),采用Checcucci等[15]的培养基培养.考虑到多溴联苯醚的一般环境浓度及其快速的环境增长速度,设置3个浓度组以评价不同情况下的毒性效应,设定浓度分别为3,3×10-2,3×10-6mg/L,每个浓度3个平行,以二甲基亚砜(DMSO)作助溶剂,并设空白(蒸馏水)和溶剂(DMSO)对照组.纤细裸藻接种浓度为1×105个/mL,置于恒温光照培养箱中培养,设置光强80～90µmol/(m2·s),温度(25±1),℃光暗周期12h:12h,连续培养7d.每天定时摇动并随机移动各瓶的位置以减少误差.

1.2微藻生长和光合色素含量测定

采用721-100型分光光度计,于680nm波长处,以培养液作空白,每天测定其吸光度,结果取3个平行的平均值.

通过血球计数板计数及纤细裸藻细胞液OD680值确定细胞数与吸光值之间的关系为y=(94.309×OD680+0.9114)×104,y为细胞数(个细胞/mL), r=0.999.

微藻培养7d后用90%丙酮提取,分别测定各组叶绿素[16]及类胡萝卜素含量[17].

1.3粗酶液提取和酶活性测定

离心收集一定量藻液重新悬浮于适量预冷磷酸盐缓冲液(pH7.0),冰浴下超声破碎(JY88-II型超声细胞破碎仪,150W,5min,其间工作10s,间隙10s),4℃低温高速离心(12000r/min,20min),取上清液做酶活性分析.可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法测定,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法,谷胱甘肽(GSH)含量采用二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反应显色测定.

酶活测定试验均以培养7d的藻液为样品,采用南京建成生物工程公司提供的试剂盒测定,测定结果取3个平行的平均值.

1.4单细胞凝胶电泳试验(SCGE)

彗星试验参照Aoyama等[12]的方法并做适当修改.常规方法制片后将载玻片浸入现配的细胞裂解液(2.5mol/L NaOH,1.0mmol/L Na2-EDTA, 0.01%SDS,pH10,试验前加入1%体积的TritonX-100,10%DMSO),4℃避光裂解20min.碱性电泳液(pH13.0)中静止解旋20min后,在电压20 V、电流200mA条件下电泳20min.随后用中性缓冲液中和,以溴化乙锭染色,每个浓度3个平行,用荧光显微镜(BX41,Olympus)在绿光激发下观察并拍照.

彗星图像分析采用CASP软件,在评价参数中,Olive尾矩(OTM)同时反映了彗尾中DNA含量和彗尾形状特征,是定量化DNA损伤程度的常用指标[18].另外提供尾动量(TM)参数作为参考指标,以便较全面反映DNA损伤情况.每张载玻片至少分析50个细胞.

1.5数据分析

采用SPSS和Origin7.0软件进行数据统计分析,将试验组与对照组进行显著性t 检验,以P＜ 0.05作为显著性依据.

2 试验结果

2.1BDE-15对纤细裸藻生长的影响

由图1可见,在设定的浓度范围内,BDE-15浓度较低时,对藻类生长无显著影响,最高浓度时(3mg/L)生长受到显著抑制,抑制率为空白对照组的69.70%(P＜0.01),溶剂对照组(DMSO)对微藻生长无显著影响.

图1 不同浓度BDE-15下纤细裸藻生长曲线Fig.1 Growth curves of E. gracilis treated with different concentrations of BDE-15

2.2BDE-15对光合色素含量的影响

由图2可见, BDE-15对叶绿素,类胡萝卜素均有一定的促进作用,其中低浓度组(3×10-2mg/L)影响不大,高浓度组(3mg/L)色素含量升高显著,与空白对照相比,叶绿素和类胡萝卜素含量分别提高了53.34%(P＜0.05)和35.41%(P＜0.01).

图2 不同浓度BDE-15对光合色素含量的影响Fig.2 Effects of BDE-15 on the photosynthetic pigments of E. gracilis

2.3BDE-15对蛋白质含量的影响

由图3可见,染毒7d后,各组蛋白质含量均明显降低,与空白对照相比,溶剂对照组和不同浓度BDE-15处理组蛋白含量均明显降低,且差异显著,其中3×10-6,3×10-2,3mg/L组蛋白含量分别为空白对照的57.12%(P＜0.05),46.88%(P＜0.001)和41.22%(P＜0.001).

图3 BDE-15对蛋白质含量的影响Fig.3 Protein content of E.gracilis treated with different concentrations of BDE-15

2.4BDE-15对抗氧化酶活性的影响

由图4可见,BDE-15染毒7d后,纤细裸藻SOD活性明显下降,表现出一定的剂量-效应关系.3×10-6,3×10-2mg/L组的SOD活性分别下降至对照组的47.61%和35.44%(P＜0.001),当BDE-15浓度达到3mg/L时,已检测不到SOD活力.而POD活性则随BDE-15浓度增加呈上升趋势,最高浓度组(3mg/L)比空白对照组POD活性提高了93.45%,但无统计学差异.

2.5BDE-15对GSH含量的影响

由图5可见,染毒7d后,随BDE-15浓度升高,GSH含量明显下降,3×10-6,3×10-2,3mg/L各组GSH含量分别比空白对照下降32.50%(P＜0.01), 54.70%(P＜0.001)和57.97%(P＜0.001).

2.6BDE-15对纤细裸藻DNA的损伤

由图6可见,染毒7d后,随着BDE-15浓度升高,DNA损伤加重.在BDE-15浓度为3×10-6, 3×10-2,3mg/L时,其OTM值分别为空白对照的2.14倍,2.09倍和6.22倍(P＜0.05).TM值分别为空白对照的1.66倍,1.67倍和4.36倍(P＜0.05).

图4 BDE-15对SOD和POD活性的影响Fig.4 SOD and POD activitiy of E.gracilis treated with different concentrations of BDE-15

图5 BDE-15对GSH含量的影响Fig.5 GSH content of E.gracilis treated with different concentrations of BDE-15

图7显示了未受损伤和严重损伤(3mg/L)的彗星图片,由图7(b)可明显观察到DNA的断裂与移动,形成了明显的彗尾.

图6 不同浓度BDE-15对纤细裸藻DNA损伤Fig.6 Induction of DNA damage (olive tail moment) in E. gracilis following exposure to different concentrations of BDE-15

图7 未受损伤和受损严重微藻的彗星图片Fig.7 Typical comet image of microalgae E. gracilis cells in control and significant damage one

3 讨论

光合色素是在光合作用中参与吸收、传递光能或原初光化学反应的色素.植物光合色素一般包括叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)和类胡萝卜素(Car).叶绿素含量作为生物生长的重要生理参数,表征了作物的生产能力,与光合特性密切相关,在一定范围内与光合速率成正相关,并可影响植物的表观量子效率.本试验中BDE-15对叶绿素a与类胡萝卜素的影响大致相同,二者均随BDE-15浓度增加而增加,而藻类细胞密度则有下降趋势,这说明藻类对光能的利用有较强的主动性,即可以通过调节自身的光合色素而利用光能,而BDE-15的存在一定程度上提高了微藻细胞的光合效率,这种色素组成上的变化也可以作为一种指标来监测环境中有机物的污染状况.

蛋白质是细胞代谢的物质基础.BDE-15对纤细裸藻的影响也体现在蛋白质的变化.在本试验的浓度范围内,随着BDE-15浓度增大,蛋白质含量迅速下降.徐勤松等[19]也发现在0～10mg/L范围内,随着Cu浓度升高,黑藻植株中可溶性蛋白含量一直下降,呈显著负相关,与本实验结果类似.植株体内可溶性蛋白含量的下降可能是由于蛋白质与-SH基结合导致蛋白质变性而降解,也可能是蛋白质合成酶的失活或DNA转录翻译途径受阻,影响了蛋白质的合成.造成本实验蛋白质代谢结果的具体原因有待于进一步研究.

近年来,SOD和POD作为植物体内清除活性氧、保护植物细胞免受伤害的2种保护性酶进行了大量研究.植物体在受到轻度环境胁迫时,SOD和POD活性有所升高,以增强植物对活性氧的清除能力;而受到重度逆境胁迫时,SOD和POD的活性又会大幅度降低,造成活性氧的积累和细胞的伤害[14],这种活性的降低是微藻细胞内活性氧过量产生,导致细胞膜脂过氧化及细胞伤害的主要原因之一[20].以上规律在本试验中得到证实:随着BDE-15浓度的升高,纤细裸藻SOD活性受到了明显抑制,表现一定的剂量-效应关系.POD活性则随BDE-15浓度升高呈现一定上升趋势.可以推测即使在较低浓度BDE-15胁迫下,SOD作为微藻中抗氧化的第一道防线, 其清除能力即被削弱;而POD则仍能维持在相对较高的水平以清除活性氧.Zhang等[21]也得到类似结果.这也说明BDE-15的加入影响了纤细裸藻的抗氧化酶系统, SOD表现更为敏感.

GSH是由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)通过肽键缩合而成的非蛋白巯基三肽化合物,是用途广泛的活性短肽.它是一种抗氧化剂和自由基清除剂,同时具有调节其他抗氧化剂的作用.本试验中,经DMSO处理的纤细裸藻(溶剂对照组),其GSH含量相比空白对照明显下降,说明DMSO对藻类会产生一定影响,但是根据图1 生长曲线可知,这种影响在藻类的生理可调范围之内,彗星实验结果也说明DMSO不会带来明显的遗传毒性效应.但其他浓度组GSH含量进一步明显下降,说明BDE-15会对藻类的抗氧化功能造成损害,影响藻类清除自由基的能力.

彗星实验在毒理学中具有独特的优势.Olive尾矩同时反映了彗尾中DNA含量和彗尾形状特征,能够较好地定量DNA的损伤程度[22-23].另外提供尾动量(TM)参数作为参考指标,从而更全面反应DNA损伤情况.在本试验中,BDE-15的加入量与纤细裸藻DNA分子损伤程度表现出较为明显的相关性,可以作为检测BDE-15遗传毒性的重要指标与依据.

4 结论

4.1低浓度BDE-15(3×10-6mg/L)对纤细裸藻的生长影响不显著,但已经可以引起细胞的氧化损伤,产生了一定程度的过氧化作用,造成细胞中总可溶蛋白含量、GSH含量及抗氧化酶活性下降.4.2高浓度的BDE-15(3mg/L)导致了纤细裸藻细胞色素含量的增加,蛋白质和GSH浓度以及SOD活性明显下降,表现出很强的氧化胁迫效应.其中SOD表现最为敏感.

4.3彗星试验结果显示,低浓度BDE-15即可引起纤细裸藻DNA的明显损伤,且损伤程度随BDE-15浓度增加而加重,说明高浓度BDE-15具有较为明显的遗传毒性效应.

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ZHANG Qiong, WU Qin, GAO Xiang-yu, KONG Zhi-ming, LI Mei*(State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of Environment, Nanjing University, Nanjing 210093, China). China Environmental Science, 2010,30(6)：833～838

X503

A

1000-6923(2010)06-0833-06

张 琼(1987-),女,回族,安徽省桐城市人,南京大学环境学院硕士研究生.主要从事环境毒理学方向研究.

2009-11-02

江苏省社会发展项目(BS2007049);国家“973”项目(2008CB418003)

* 责任作者, 副教授, meili@nju.edu.cn