长期施用粪肥土壤中喹诺酮类抗生素的含量与分布特征

邰义萍,莫测辉*,李彦文,2,吴小莲,邹 星,高 鹏,黄显东(.暨南大学环境工程系,广东省高校水土环境毒害性污染物防治与生物修复重点实验室,广东 广州 50632；2.暨南大学水生生物研究所,广东 广州 50632)

长期施用粪肥土壤中喹诺酮类抗生素的含量与分布特征

邰义萍1,莫测辉1*,李彦文1,2,吴小莲1,邹 星1,高 鹏1,黄显东1(1.暨南大学环境工程系,广东省高校水土环境毒害性污染物防治与生物修复重点实验室,广东 广州 510632；2.暨南大学水生生物研究所,广东 广州 510632)

针对珠江三角洲地区长期施用粪肥的“无公害蔬菜”生产基地,利用固相萃取-高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析方法,探讨了土壤中喹诺酮类(QNs)抗生素4种化合物的含量与分布特征.结果表明,土壤中4种化合物的总含量(ΣQNs)为3.97～32.03µg/kg,平均17.99µg/kg.各化合物的检出率除了洛美沙星(92%)以外均为100%,最高含量为17.21µg/kg,平均含量为0.17～9.31µg/kg,以环丙沙星为主,其次是诺氟沙星和恩诺沙星.化合物的含量与组成特征无论在平面上还是在剖面上均存在明显的空间分布差异,且随着深度增加含量迅速降低,但在80cm深度仍有检出.珠江三角洲地区长期施用粪肥蔬菜基地土壤中喹诺酮类抗生素含量较低,土壤生态毒性风险较小,但各化合物均很高的检出率而导致的协同生态毒性尤其是耐药性问题值得进一步研究.

土壤；粪肥；喹诺酮类抗生素；污染

Abstract：The concentration and distribution of quinolone antibiotics in soil of vegetable field chronically fertilized with manures was studied using solid-phase extraction followed by high-performance liquid chromatography- electrospray ionization tandem mass spectrometry. The total concentrations of four quinolone compounds ranged from3.97 to 32.03µg/kg with an average of 17.99µg/kg. There were very high detection rates (above 90%) observed for four compounds which dominated mostly with ciprofloxacin and secondly with norfloxacin and enrofloxacin. The concentrations of these compounds were all comparatively lower, with maximum concentration of 17.21µg/kg and average concentrations of 0.17～9.31µg/kg. There was obvious difference in spatial distribution of concentration and constitute of quinolone compounds in both horizontal and profile soil. All four compounds decreased rapidly with soil depth, but they were still detected at soil depths between 60 and 80cm. Quinolone antibiotics in soils from vegetable field chronically fertilized with manure in subtropical area were high frequently detected, but the concentration of them was comparatively lower and the ecotoxic risk was less owing to high degradation of antibiotics under hot and humid climate and heavy cultivation.

Key words：soil；manures；quinolone antibiotics；pollution

规模化畜禽养殖中大量使用喹诺酮类、四环素类和磺胺类等各种抗生素[1-2].抗生素使用后通常大部分以药物原形或其代谢物随粪尿排出[3],造成动物粪便中抗生素的含量普遍较高,甚至高达数十mg/kg以上[4-9],成为环境中抗生素的重要来源.而且,规模化畜禽粪便广泛作为有机肥料大量施用于农业生产,造成土壤抗生素残留污染[5-7,10-12],其输入量甚至不亚于农药施用量[4],并通过干扰土壤微生物的群落结构与功能[12-13]而影响土壤肥力,也可被作物吸收累积[14-15]而危及农产品质量安全.此外,土壤抗生素污染还可通过地表径流和淋滤作用造成水体的抗生素污染[16-18],并引发细菌耐药性[19],威胁动物与人类健康.因此,抗生素已成为一类重要环境有机污染物和环境科学研究的热点,但研究工作主要集中在水环境污染及其生态效应方面[16-18,20],而对于土壤环境污染及其生态效应的研究较少[5-7,12-13],我国相关报道较少[10-12].富含抗生素的规模化畜禽粪便长期施用而导致的土壤抗生素污染,污染状况与抗生素种类、气候条件、生产方式等各种因素密切相关.本研究针对畜禽养殖中广泛使用的喹诺酮类(QNs)抗生素,探讨珠江三角洲地区长期施用粪肥的“无公害蔬菜”生产基地土壤中4种喹诺酮类化合物的含量与分布特征,为粪肥安全施用和土壤抗生素污染控制提供科学依据.

1 材料与方法

1.1仪器与试剂

固相萃取装置(VisiprepTM-DL,Supelco)、Oasis HLB固相萃取柱(3mL/60mg,Supelco)、数控恒温水浴、恒温震荡器、超声波清洗器、低速离心机,以及高效液相色谱(Agilent1100)、电喷雾(ESI)离子源串联质谱仪(AB4000QTRAP).

喹诺酮类(QNs)抗生素4种化合物分别为诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、洛美沙星(LOM)、恩诺沙星(ENR),其标准品均购自德国Ehrenstorfer GmbH公司,纯度大于98%.甲醇、乙腈均为色谱纯(Sigma公司),其他化学试剂均为分析纯,实验用水为高纯水.喹诺酮类化合物标准品母液:准确称取0.0100g标准品溶于少量乙酸溶液,用乙腈/水(20/80,V/V)稀释定容至100mL,配制成浓度为100µg/mL的标准品储备液,在4℃下避光保存.实验中各种浓度的标准品工作液均用乙腈/水(20/80,V/V)按一定比例稀释得到.校正曲线工作液浓度范围为0.001～0.5µg/mL.50%硝酸镁溶液:50gMg(NO3)2·6H2O溶于100mL水,可提前配制,室温保存.10%氨水溶液:按10mL25%氨水加入100mL水的比例配制,现配现用.

1.2样品采集与预处理

研究区为地处亚热带湿热气候条件(年均气温21.9,℃年降雨量1682.8mm)的珠江三角洲地区某现代化农业生态园区内“无公害蔬菜”生产基地,面积约1000500m2,由企业(连片66700m2以上)或各农户(6670m2/户左右)经营,以北江清洁水源灌溉,长期施用畜禽粪肥作为有机肥(每年约0.4kg/m2),同时施用一定量化肥.土壤母质为河流冲积物,土壤类型为水稻土,质地多为砂土或砂壤土.

根据生产方式、蔬菜品种和环境条件等因素,按环境监测要求选择13个采样地块,分别以多个点位采集表层土壤(20cm)组成混合样.同时对大白菜和苦麦菜菜地分别采集土壤剖面样品(0～20, 20～40,40～60,60～80cm).样品采集后按四分法缩减,于室内冷冻干燥后粉碎过60目筛备测,其中表层土壤样品13个,2个不同蔬菜土壤剖面样品各4个.表层土壤pH值为弱酸性,随着深度向中性演化.样品预处理方法参考文献[21]进行.准确称取1.00g土壤样品置于10mL离心管中,加入50%硝酸镁-10%氨水(96/4,V/V)4mL,振荡5min,超声提取15min,离心(4500r/min)8min,收集上清液.残渣用上述方法反复提取2次.合并上清液,再过HLB固相萃取小柱(先后过6mL甲醇和6mL水)萃取富集.用6mL高纯水清洗小柱,真空干燥10min,再用3mL乙酸-乙腈(1/99, V/V)洗脱小柱.洗脱液在40℃水浴下用氮气吹至近干,用乙腈-水(20/80,V/V)定容至1mL,溶液过0.22µm滤膜收集于样品瓶中待测.

1.3LC-MS/MS分析

LC-MS/MS分析条件参考文献[22].色谱条件:色谱柱为Ailent Eclipse Plus C18(5µm, 2.1mm×150mm);柱温20;℃柱平衡时间30min;流动相为水(含1%甲酸)-乙腈(含1%甲酸)(80/20, V/V;),流速为0.2mL/min;进样量5µL.质谱条件:离子化模式为ESI(+);雾化气为60psi;干燥气为50psi;气帘气为20psi;离子源电压5500V;去溶剂温度600℃;碰撞气压水平为高压.

1.4质量控制与质量保证

以喹诺酮类抗生素的脱羧离子([MH-CO2]+)为定量离子.喹诺酮类抗生素4种化合物的加标回收率在54.8%～76.5%之间(表1),相对标准偏差(RSD,n=3)均低于1%.以混合标准品工作液系列浓度为1.0,10.0,50.0,100.0,500.0µg/L,建立各化合物标准曲线的线性回归方程,并根据1.0µg/L混合标准品工作液色谱峰,按3倍信噪比计算方法检测限,按10倍信噪比计算样品定量限(表1).为控制实验过程中人为污染,保证操作过程准确,每10个样品间隔设置空白样、样品平行样、样品加标样,并且在进样时以固定浓度标样进行质量控制.空白样中未检出喹诺酮类化合物,平行样检测结果相对标准偏差均＜5%.整个分析流程诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星和恩诺沙星的回收率分别为67.5%～82.5%、56.8%～78.2%、66.3%～77.1%和65.6%～73.2%.

表1 土壤中喹诺酮类化合物的回收率、检测限与定量限Table 1 Recovery, limit of detection, limit of quantification of quinolone antibiotics in soil

2 结果与讨论

2.1表层土壤中喹诺酮类抗生素的含量

研究区为“无公害蔬菜”生产基地,以清洁江水进行灌溉,因此土壤中抗生素主要来源于粪肥的施用.由表2可见,表层土壤中喹诺酮类抗生素4种化合物总含量为3.97～32.03µg/kg,平均17.99µg/kg,＜10µg/kg与20～30µg/kg的样品各占30.8%和30.7%,10～20µg/kg与＞30µg/kg的样品分别占23.1%和15.4%.诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的检出率均为100%,其含量范围分别为0.52～13.13,2.90～17.21,0.55～15.46µg/kg,平均含量分别为4.98,9.31,3.52µg/kg.洛美沙星的检出率为92%,且其中大部分(76.9%)低于定量限,最高含量仅为1.96µg/kg.因此,表层土壤中喹诺酮类化合物组成以环丙沙星为主,其次为诺氟沙星和恩诺沙星,而洛美沙星的含量很低.

表2 表层土壤中喹诺酮类抗生素的含量(µg/kg)Table 2 Concentrations of quinolone antibiotics in top soils (µg/kg)

虽然研究区长期施用粪肥土壤中喹诺酮类化合物的检出率高达90%以上,但各化合物平均含量均低于10µg/kg,最高含量均低于20µg/kg,也低于土耳其、澳大利亚等施用粪肥土壤中喹诺酮类化合物的含量[6-7].影响施用粪肥土壤中抗生素的含量与环境行为的因素很多,包括抗生素种类、气候条件、土壤特性、土地利用方式、耕作方式(如种植、施肥、灌溉)等.通常磺胺类抗生素在粪肥中的含量较高,而在施用粪肥土壤中的含量较低,但喹诺酮类和四环素类抗生素的情况则相反[7];施用粪肥本身尤其是粪肥施用量越大、连续施用以及在湿、热气候条件下施用了均有利于土壤中抗生素的降解,从而降低土壤污染程度[23-27].这是研究区长期施用粪肥土壤中抗生素的含量甚至比一般农业土壤如东莞市普通蔬菜生产基地土壤中抗生素含量更低的重要原因,一般农业土壤中抗生素的含量可来源于灌溉水等途径[28].另外,类似于土壤中有机污染物的植物修复作用一样[29],在蔬菜生产中较高的复种指数和经常性的轮作也有利于施用粪肥土壤中抗生素的降解而减轻污染程度,这也可能是研究区土壤中喹诺酮类抗生素含量低于土耳其、澳大利亚等施用粪肥土壤中喹诺酮类化合物含量的重要原因[6-7].根据兽药国际协调委员会(VICH)筹划指导委员会关于抗生素产生生态毒性效应的阈值100µg/kg进行生态风险评估[7],研究区土壤中喹诺酮类化合物及其总含量均低于该值,生态毒害风险较小,但各化合物之间的联合毒性以及耐药性问题需要进一步研究.

2.2不同植物土壤中喹诺酮类抗生素的含量与组成特征

图1 不同植物土壤中喹诺酮类抗生素特征Fig.1 Occurrence of quinolones in soils grown differentspecies of vegetables

种植不同植物土壤中喹诺酮类化合物的含量及组成特征差异明显(图1).4种喹诺酮类化合物的总含量以苦麦菜土壤中的最高(31.19µg/kg),其次是西兰花和香蕉土壤(22.68～22.71µg/kg)以及大白菜、菜心、韭菜和油麦菜土壤(12.95～16.80µg/kg),而葱、萝卜土壤中的最低(7.33～9.18µg/kg),最高与最低之间相差4倍以上.从单个化合物的含量与组成特征来看,苦麦菜土壤中以环丙沙星和恩诺沙星为主,西兰花土壤中以诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星为主,香蕉、大白菜、菜心、韭菜、油麦菜和葱土壤中均以诺氟沙星和环丙沙星为主,而萝卜土壤中以环丙沙星为主.另外,同种植物不同地块土壤中喹诺酮类抗生素的含量与组成特征也有明显差异,如4个不同地块的大白菜土壤中喹诺酮类化合物总含量为3.97～32.03µg/kg,其中大白菜1和大白菜2土壤中以诺氟沙星和环丙沙星为主,而大白菜3和大白菜4土壤中以环丙沙星为主(图2).不同植物对土壤中有机污染物的降解情况存在明显差异[29],与植物根系分泌物等生理生化特征以及根际微生物种群结构与功能的差异等因素有关,这可能是导致种植不同植物土壤中喹诺酮类抗生素含量和组成差异的重要原因之一.各农户之间不同的生产方式(如施肥、灌溉、轮作等)会造成土壤中喹诺酮类抗生素的降解性、迁移性等环境行为的不同[30],也是导致不同地块土壤中喹诺酮类抗生素含量与组成特征差异的重要原因.

图2 不同地块大白菜土壤中喹诺酮类抗生素特征Fig.2 Occurrence of quinolones in different soils grown Chinese cabbage

2.3土壤剖面中喹诺酮类抗生素的含量与分布特征

喹诺酮类抗生素在土壤中具有较强的吸附性和较弱的活动性[3],因此在土壤剖面中喹诺酮类4种化合物的含量均随着深度的增加而迅速降低,到60～80cm深度时含量降至2µg/kg以下,甚至低于定量限或检测限(图3).从喹诺酮类抗生素4种化合物的总含量来看,种植大白菜的土壤剖面不同深度0～20cm,20～40cm,40～60cm,60～80cm的∑QNs分别为22.04,11.85,4.83,1.94µg/kg,在表层0～20cm以下各段的降低幅度差别不大,分别为46%、59%和60%;种植苦麦菜土壤剖面不同深度0～20cm,20～40cm,40～60cm,60～80cm的∑QNs分别为31.19,4.37,3.99,0µg/kg,在表层0～20cm以下各段的降低幅度差别较大,分别为86%、9%和100%.从各化合物的组成与含量来看,大白菜土壤剖面不同深度的化合物组成特征几乎未发生变化,均以环丙沙星为主,其次为诺氟沙星和恩诺沙星,且各化合物在表层0～20cm以下各段的降低幅度差别较小.洛美沙星由低于定量限下降到低于检测限,恩诺沙星在60～80cm时也降低到定量限以下;苦麦菜土壤剖面不同深度化合物的组成及其含量变化情况均较复杂,在0～20cm时以环丙沙星和恩诺沙星为主,而在20～40cm和40～60cm时以环丙沙星为主,且各化合物在表层0～20cm以下各段的降低幅度差别较大.在20～40cm时诺氟沙星的含量反而略有升高,环丙沙星和恩诺沙星的降低幅度则分别高达81%和95%,到60～80cm时三者均低于检测限,而洛美沙星在剖面各段均被检出但都低于定量限.2个土壤剖面中喹诺酮类化合物的组成与含量变化的差异与不同植物根系生理生化特征和各农户生产方式不同有关,如耕作方式不同影响着土壤中抗生素的活动性与迁移性[30].

图3 土壤剖面中喹诺酮类抗生素的含量与分布特征Fig.3 Composition and level of quinolone compoundsin soil profiles

3 结论

3.1珠江三角洲地区长期施用粪肥“无公害蔬菜”生产基地土壤中4种喹诺酮类化合物的总含

量为3.97～32.03µg/kg,平均17.99µg/kg.各化合物的检出率在92%以上,最高为17.21µg/kg,平均含量为0.17～9.31µg/kg,以环丙沙星为主,其次是诺氟沙星和恩诺沙星.

3.2化合物的含量与组成特征在平面或剖面空间分布上均存在明显差异,随着深度含量迅速降低,但在深度80cm仍有检出.

3.3珠江三角洲地区长期施用粪肥蔬菜基地土壤中喹诺酮类抗生素虽然普遍检出但含量较低,高复种指数和湿热气候条件有利于土壤中抗生素的降解而减轻污染程度,土壤生态毒性风险较小.

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TAI Yi-ping1, MO Ce-hui1*, LI Yan-wen1,2, WU Xiao-lian1, ZOU Xing1GAO Peng1, HUANG Xian-dong1(1.Key Laboratory of water/soil Toxic Pollutants Control and Bioremediation, Department of Education of Guangdong Province, Department of Environmental Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China；2.Institute of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 510632, China). China Environmental Science, 2010,30(6)：816～821

X53

A

1000-6923(2010)06-0816-06

邰义萍(1984-),女,安徽滁州人,暨南大学环境工程系硕士研究生,主要从事土壤有机污染和农产品安全研究工作.发表论文1篇.

2009-11-13

国家自然科学基金资助项目(30671208,40773062);广东省自然科学基金重点项目(07117909);东莞市科技计划项目(2008108101110);惠州市科技计划项目(09B010001009)

* 责任作者, 教授, tchmo@jnu.edu.cn