大鼠实验性流产模型的建立及黄芪多糖对其的影响

吴玉泓，魏彦明，郭延生

(1.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070;2.甘肃中医学院基础课部，兰州 730000)

研究报告

大鼠实验性流产模型的建立及黄芪多糖对其的影响

吴玉泓1，2，魏彦明1，郭延生1

(1.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070;2.甘肃中医学院基础课部，兰州 730000)

目的应用细菌脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)尾静脉注射建立大鼠实验性流产动物模型，研究黄芪多糖(astragalus polysacharin，APS)对实验性流产大鼠保胎的作用。方法采用怀孕第7天Sprague–Daw ley (SD)大鼠尾静脉注射LPS每只1.0 μg，建立实验性大鼠流产模型，以正常怀孕大鼠尾静脉注射磷酸缓冲液(PBS)每只1.0 m L作为对照组，随机将模型组大鼠分为流产模型组、APS组。APS组于怀孕4～9 d口服APS 2 m L (150mg)/d，对照组与和流产模型组分别于4～9 d口服生理盐水2 mL/d。于实验第10天麻醉处死各组大鼠，计数妊娠成功比例和流产比例。结果LPS诱导大鼠流产模型组流产比例高达8/11，而对照组和APS组流产比例分别为1/12和1/6，与流产模型组比较差异极显著(P＜0.01)。结论LPS可以诱导建立大鼠流产模型，中药成分APS对实验性大鼠流产具有一定的保护作用。

大鼠;细菌脂多糖;流产模型;黄芪多糖

早期胚胎死亡或胚胎丢失，又称隐性流产，严重影响母畜繁殖力与生产力。有研究表明，哺乳动物着床后的胚胎大约有40%～60%不能发育到正常分娩便发生死亡，其中早期胚胎死亡约占2/3［1，2］。人的妊娠约75%以失败而告终，由于大部分发生在围着床期，即多数为早期流产，因此也称为自然流产(spontaneous abortion，SA)，由于无明显症状或仅表现为月经过多或合并月经延迟，因此，并未引起患者和临床医师的重视［3］。国内资料介绍，牛的早期胚胎丢失率在38%，猪、羊约在30%左右［4］。转基因动物研究在基因构建、显微注射等方面耗费巨资，但是胚胎移植给受体后的成活率不高，造成了极大的人力、物力的浪费。荷兰Leiden大学所做转基因牛的研究结果是，发育良好的胚胎移入受体子宫后的成活率为14.7%［5］;国内扬州大学研究转基因牛、羊，其胚胎成活率也仅为12.8%［5］。显然，反复自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是困扰生殖生物学家的难题之一，虽然其主要原因有基因缺陷、解剖异常、内分泌紊乱和感染，但60%～70%的流产难以解释其发生的原因［6］。Zhal和Bjerknes (1943)、Rieder和Thomas(1960)及Mokay和Wong (1963)的研究表明，细菌脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)能够诱发大鼠和小鼠的胚胎吸收［7－9］。因此，本研究应用LPS尾静脉注射以建立实验性流产大鼠动物模型，并应用中药成分黄芪多糖(astragalus polysacharin，APS)干预，以研究早期流产的发生原因和APS对其的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择12周龄未经产Sprague－Daw ley(SD)雌性大鼠100只，体质量202～238 g，雄性SD大鼠50只，均来源于甘肃中医学院科研实验中心【医动字SCXK(甘)2004－2006】。实验动物常规饲养，自由采食和饮水，每日光照12 h，适应环境1周后，阴道涂片法进行发情鉴定，选用有4d左右正常性周期的大鼠，根据阴道涂片确定发情期的不同阶段。

1.2 药品、试剂

APS:取干燥黄芪饮片(甘肃岷县，经本研究室鉴定)，分离、提取，含量为78%。

LPS(北京经科化学试剂经营公司，Sigma L－6386)。

1.3 大鼠妊娠的确定

选择发情周期正常的未经产雌性大鼠，于前1 d pm 19:00按雌雄2∶1合笼，次日am 7:00按检查阴道涂片发现精子者定为妊娠第1天。

2 大鼠实验性流产模型的建立预实验

2.1 建模方法及结果

选择雌性SD大鼠30只，雄性15只，按雌雄2∶1合笼，次日am 8:00～9:00检查阴道内有精子者定为妊娠第1天，将32只阴道检出精子的母鼠分别按表1方法进行处理，以确定大鼠实验性流产模型建立的方法。各组实验大鼠用不同剂量的LPS在妊娠不同天数处理后的实验结果见表1。从表1可以看出，尾静脉注射LPS可引起妊娠大鼠流产，注射0.5 μg时很少发生流产;不论妊娠第5天还是第7天，注射1.5 μg LPS时可导致绝大多数妊娠大鼠流产，子宫内无胎儿，无法计算死胎数;妊娠第5天或第7天静脉注射1.0 μg LPS，可引起妊娠大鼠流产，以妊娠第7天注射LPS，妊娠第10天剖检可导致全部妊娠大鼠流产。因此，实验选择妊娠第7天尾静脉注射LPS 1.0 μg，第10天剖检。

2.2 正常胚胎、流产胚胎的判定标准

参照Clark(1980)等［1］的方法，即正常胚胎:子宫内无瘀血，胚胎发育良好，个体较大，呈淡红色;流产胚胎:剖检时子宫呈“竹节状”，胚胎体积明显缩小，子宫内胚胎呈黑褐色，胎儿胎盘有明显的出血或坏死。

流产率=流产动物数/(流产动物数+未流产动物数)×100%

3 APS含量测定和应用剂量的确定

3.1 APS总糖含量测定

常规水提醇沉的方法提取APS，除蛋白，冷冻干燥得APS。按以下方法制作标准曲线，测定APS含量。①精密称取105℃干燥至恒定的葡萄糖标准品100 mg，置100 m L容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。②精密汲取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 m L葡萄糖标准品溶液，分别置于50 m L容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。③精密汲取上述各种溶液2.0 mL，迅速加入5%草酚溶液1.0 m L，摇匀，再迅速加入浓硫酸5.0 m L，振摇5 min，置沸水浴上加热15 min，然后置冷水浴中冷却30 min。④在分光光度计490 nm处测定吸光度，以标准溶液浓度(X)为横坐标，吸光度值(Y)为纵坐标绘制标准曲线。见图1。APS样品含量测定及结果:①精密称取APS样品50 mg，于50 m L容量瓶定容至刻度。②精密汲取APS样品液2 m L，置50 m L容量瓶定容，摇匀。③精密汲取以上溶液2 m L，按标准曲线方法操作，用标准曲线计算多糖含量，多糖糖含量为78%。④应用紫外分析仪检测，在260 nm和280 nm处未见吸收峰，说明不含蛋白质和核酸。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

3.2 APS剂量的确定

根据大鼠与人的用药量换算公式［10］，按每只大鼠体重200 g，每日灌胃2 mL进行计算，每只大鼠每天的APS用量相当于50 kg体重的成人每日两剂的药量。

4 流产模型的建立及APS的作用

4.1 实验方法

按预实验相同的方法，选择阴道涂片发现精子的大鼠36只，按表2分组实验。

表1 大鼠实验性流产动物模型的建立预实验及结果Tab.1 The development and results of the preliminary experiment of LPS－induced abortion in rats

表2 实验性大鼠流产模型的建立及中药作用的实验方法(m L)Tab.2 Experimental methods of establishment of the rat model of LPS－induced abortion and the effect of the Chinese herbs

4.2 各组大鼠妊娠成功率及流产率

如表3所示，流产模型组妊娠成功比例为3/ 11，对照组妊娠成功比例为11/12，APS组妊娠成功比例为5/6。对照组与APS组比较差异不显著(P＞0.05);对照组和APS组与流产模型组比较均具有极显著性的差异(P＜0.01)。

表3 实验性大鼠流产模型的建立及APS对其影响Tab.3 Effects of the Chinese herbs on the LPS－induced abortion in rats

5 讨论

流产是指由于胎儿或母体异常而导致妊娠的生理过程发生紊乱，或它们之间的正常关系受到破坏而导致的妊娠中断，虽可以发生在妊娠的各个阶段，但以妊娠早期较为多见。各种家畜均可发生流产，尤其是早期胚胎死亡在流产中占有相当大的比例，各种动物均可发生，如马妊娠60d之前，胚胎死亡率可达18%。在动物早期胚胎死亡和反复自然流产的结果是导致屡配不孕或发情推迟以及妊娠率降低，严重影响动物的生产性能［6］。

黄芪是一种补气药物，含有多糖、生物碱、氨基酸、黄酮类、甙类、微量元素等多种生物活性物质，其中APS的免疫活性尤为突出。现代医学研究表明，黄芪除能增强机体免疫功能，促进细胞代谢，调节DNA、RNA和蛋白质的合成外，还兼有固肾降压、保肝消炎等功效。目前，APS已开始陆续应用于兽医临床，能提高动物的抗病能力，降低发病率。但关于降低实验动物流产发生率的研究未见报道。

本研究应用LPS尾静脉注射成功的建立了大鼠实验性流产动物模型，为进一步研究引起早期流产的发生原因提供了依据。实验结果表明，流产模型组于怀孕第7天尾静脉注射LPS1.0 μg流产比例达8/11，同期对照组流产比例仅为1/12，两者之间差异极显著(P＜0.01);APS干预组流产比例为1/6，与流产模型组之间有着显著性差异(P＜0.01)。实验同时发现流产模型具有Th1和Th2辅助性细胞因子分泌失调表现，即LPS诱导流产模型表现为Th1细胞因子作用增强而Th2细胞因子作用降低，Th1细胞因子的分泌与作用超过并阻断了Th2细胞因子的分泌与作用，而正常对照组和APS干预组则相反，雌孕激素受体发生变化和明显的子宫局部或全身的病理变化(另文报道)。LPS可以诱发大鼠、小鼠的胚胎吸收或流产，其诱导流产的一个重要机制是引起预敏(primed)的巨噬细胞(Mф)释放TNF－α［11］。Mф受到IFN－γ刺激预致敏后，少量的LPS就会使之释放TNF－α［12］。同时，LPS本身也可刺激人外周血单核细胞和小鼠脾细胞释放IFN－γ［13，14］。这就说明，LPS既能使被IFN－γ预致敏的Mф产生TNF－α，又可以直接诱导IFN－γ的生成，而IFN－γ使更多的Mф致敏，使得TNF－α的生成量极大的增多。本研究对LPS诱导流产模型大鼠细胞因子的测定也证明了上述研究结果。

本实验根据预实验结果，在妊娠第7天尾静脉注射LPS 1.0 μg/m L，可引起妊娠大鼠8/11的流产率，达到了流产模型建立的目的，与对照组和APS干预组有极显著的差异。表明LPS通过激活体内和子宫局部Th1型细胞因子的过度表达引起早期胚胎吸收或流产，与前人的实验和临床研究报道自然流产或习惯性流产有Th1型细胞因子介导的免疫反应增强的结果一致［13－15］，而所选中药成分APS能够降低流产发生率。

［1］Clark DA，McDermott M，Sczewzuk MR.Impairment of host vs graft reaction in pregnant mice.II.Selective suppression of cytotoxic cell generation correlates with soluble suppression activity and with successful allogeneic pregnancy［J］.Cell Immunol，1980，52:106－114.

［2］Baines MG，Duclos AJ，Antecka E.et al.Decidual infiltration and activation of macrophages leads to early embryo loss［J］.Am J Reprod Immunol，1997，37:471－477.

［3］Mishell DR Jr.Recurrent abortion［J］.J Reprod Med，1993，38:250－259.

［4］赵兴绪.兽医产科学［M］.北京:中国农业出版社，2002.

［5］田小利，陈兰英.转基因动物原理:技术与应用［M］.吉林科技出版社，1995.

［6］Coulam CB.Immunotherapy for recurrent spontaneous abortion［J］.Early Pregnancy，1995，1(1):13－26.

［7］Zahl PA，Bjerknes C.Induction of decidual－placental hemorrhage in mice by the endotoxins of certain Gram negative bacteria［J］.Proc Soc Exp Biol Med，1943，54:329－332.

［8］Rieder RT，Thomas L.Studies of the mechanism involved in the production of abortion by endotoxin［J］.J Immunol，1960，84: 189－193.

［9］Mokay SG，Wong FC.Effect of bacterial endotoxins on the p lacenta of the rat［J］.Am J Pathol，1963，42:357－372.

［10］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学(第2版)［M］.北京:人民卫生出版社，1994.178－180.

［11］Beutler B，Greenwald D，Hulmes JD，et al.Identity of tumor necrosis factor and the marcrophage－secreted factor cachectin［J］.Nature Lond，1985，316:552－554.

［12］Gifford GE，Lohmann－mathes ML.Gamma interferon priming of mouse and human macrophages for production of tumor necrosis factor by bacterial lipopolysaccharide［J］.J Natn Cancer Inst，1987，78:121－124.

［13］Le J，Lin JX，Henriksen－Destefano D，et al.Bacterial lipopolysaccharide－induced interferon－gamma production:roles of interleukin 1 and interleukin 2［J］.J Immunol，1986，4525－4530.

［14］Blanchard DK，Djeu JK，K lein TW，et al.Interferon－gamma induction by lipopolysaccharide:dependence on interleukin 2 and macrophges［J］.J Immunol，1986，136:963－970.

［15］Parand M，Chedid L.Protective effect of chlorpromazine against endotoxin induced abortion［J］.Proc Soc Exp Biol Med，1964，116:906－909.

Establishm ent of a LPS-Induced Rat M odel of Abortion and the Effect of Astragalus Polysacharin on It

WU Yu－hong1，2，WEI Yan－m ing1，GUO Yan－sheng1
(1.Faculty of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;
2.School of Basic Medical Sciences，Gansu College of Traditional Chinese medicine，Lanzhou 730000)

ObjectiveTo investigate the anti－abortional effect of astragalus polysacharin(APS)on experimental aborting rats.M ethods Sprague－Dawley(SD)rats injected with lipopolysaccharides(LPS)1 μg per rat in tail vein on day 7 of pregnancy were used as aborting model，and the other injected with phosphate buffer solution(PBS)1.0 m L per rat were used as normal group.The aborting rats were random ly divided into 3 groups:the control group，the abortion model group and the group treated with astragalus polysaccharin.The control group and abortion model group were given normal saline 2 mL from day 4 to day 9 of pregnancy via gastrogavage.The treated group was given astragalus polyaccharin 2 m L via gastrogavage during the same period.All the rats were killed on day 10 of pregnancy，and the abortion rates were assessed.ResultsA high miscarriage rate up to 8/11 was observed in the LPS induced abortion group in contrast to 1/12 in the control group.ConlusionLPS－induced abortion rate in rats can be decreased by treatment with astragalus polyaccharin.

Rats;Lipopolysaccharides;Abortion model;Astragalus polyaccharin

S857.2+1，R392.7

A

1005－4847(2010)04－0341－04

2010－03－22

高等学校博士点科学研究基金(20060733007)资助项目。

吴玉泓(1967－)，男，副教授，甘肃农业大学在读博士，研究方向:中药药理与消化系统疾病研究。E－mail:yhw67@126.com。

魏彦明(1963－)，教授，博士生导师，从事中兽医医药学和临床兽医学教学、科研工作。E－mail:weiym@gsau.edu.cn。