环境雌激素实验室模拟暴露方法

刘晶靓，潘学军，黄斌，方锴，高建培

(昆明理工大学环境科学与工程学院，云南昆明 650093)

综述·进展

环境雌激素实验室模拟暴露方法

刘晶靓，潘学军，黄斌，方锴，高建培

(昆明理工大学环境科学与工程学院，云南昆明 650093)

从实验鱼类、暴露系统、暴露方式、评价指标四个方面对国内外环境雌激素的实验室暴露研究方法进行了介绍，为环境雌激素的暴露机制、毒性机理及雌激素效应的研究提供了理论依据和实验指导。

环境雌激素;实验鱼类;实验室暴露;评价指标

环境雌激素(environmental estrogens，EEs)是指能通过与雌激素受体结合或影响细胞信号途径等其他方式模仿雌激素，发挥类似于内生雌激素的作用，从而扰乱生物机体正常激素作用的化合物［1］。雌激素按来源通常分为外源性雌激素(壬基酚、双酚A、已烯雌酚、炔雌醇等)和内源性雌激素(雌二醇、雌酮、雌三醇等)。环境雌激素的存在会干扰人类及野生动物内分泌系统，从而对机体的生殖发育、免疫系统、神经系统等多方面产生异常的效应。大量的环境调查和实验室研究表明，环境雌激素会导致人类睾丸癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌等发病率的增加、动物生育率的下降、部分生态系统中动物雌雄比例的失调等［2－4］。

环境雌激素对野生动物的影响是国际上环境雌激素研究的热点，其中水生生物的暴露结果认可性较高。鱼类是水生生态系统中处于食物链顶端的水生生物，具有与哺乳动物类似的生理系统，在鱼类中发现的雌激素效应可以用来预测环境雌激素对人类的影响。因此，在实验动物的选择上，鱼类成为了环境毒理学者的首选［5］。

本文从实验鱼类、暴露系统、暴露方式、评价指标四方面对国内外典型环境雌激素实验室暴露的研究进行了总结，力求为环境雌激素实验室模拟暴露中鱼类实验动物的选择、环境雌激素实验室暴露机制、长期慢性毒性机制及雌激素效应的研究提供实验和理论依据。

1 实验鱼类

鱼类在水生生态系统中处于食物链顶端，可在其各组织和脂肪中富集环境雌激素，当浓度达到阈值时便会影响其生长、发育、成熟、繁殖，甚至导致死亡。目前在国际上使用较多的实验鱼类主要包括青鳉、黑头软口鲦、斑马鱼和虹鳟等［6］。我国鱼类实验动物的研究相对较落后，但一些研究机构也已筛选出一些比较有特色的实验鱼种，其中稀有鮈鲫作为实验鱼类在环境雌激素的研究中得到了广泛应用。

1.1 青鳉

青鳉(Oryzias iatipes)是一种淡水鳉科鱼类，分布于日本、朝鲜、中国台湾和东南亚等国家或地区。青鳉个体小，全长3.0～4.0 cm，成熟期短(6～8周)，卵壳透明易观察，适合在实验室条件下饲养和培育。成年鱼的性别可以通过观察臀鳍和背鳍的形状进行较准确的区分。早在上世纪50年代青鳉就被用作实验鱼类，其基础生物学的研究比较充分［7］，目前全世界众多研究机构使用青鳉作为实验鱼类进行环境雌激素的研究［8］。

1.2 黑头软口鲦

黑头软口鲦(Pimephale spromelas)，一种普通的淡水小型鲫科鱼类，被广泛用于水生毒性测试，目前是经济合作与发展组织(OECD)和美国环境保护局(USEPA)推荐的鱼类实验动物。早期分布范围局限于北美中部，现在已经被引种到北美的大部分地区。黑头软口鲦个体小，全长为3.5～7.5 cm，4～5个月就达到性成熟。最重要的是，黑头软口鲦经实验室模拟暴露后的产卵量、孵化率、受精率等繁殖指标不太容易受实验室人为操作的影响［9］。同时众多的实验结果表明，黑头软口鲦是进行环境雌激素研究较理想的实验鱼类［10，11］。

1.3 斑马鱼

斑马鱼(Brachydanio rerio)是一种鲤科小型鱼类，原产于印度和缅甸东部。斑马鱼个体小，全长4～5cm，生命周期短(4个月)。斑马鱼在性分化之前处于雌雄同体阶段，无显著的第二特征，成年雌雄依靠体色以及臀鳍来区分［12］。斑马鱼最早用于遗传学研究，但随着转基因斑马鱼的问世，在环境雌激素研究中的适用范围也变得非常广泛［13，14］。

1.4 虹鳟

虹鳟(Oncorhynchus mykiss)是冷水性鱼类，个体较大。虹鳟达到性成熟的时间长，繁殖的季节性强，性成熟个体沿侧线有一条宽的彩虹色带。在毒性测试中，虹鳟不适合性分化、性成熟以及繁殖效应的评估［15］，在环境雌激素的研究中多用其幼鱼作为实验鱼类［16，17］.

1.5 稀有鮈鲫

稀有鮈鲫(Obiocypris rarus)是我国西南地区特有的一种小型鲤科鱼类。该鱼个头小，生命力强，适合在实验室饲养。其繁殖周期短，产卵批次多，繁殖力比较强。稀有鮈鲫对化学毒物较敏感，与世界上常用的小型实验鱼类相比具有相似的生物学特点，在中国稀有鮈鲫已成为一种理想的毒性实验材料而得到广泛运用［18］。

除稀有鮈鲫外，我国用于环境雌激素研究的鱼种还有一些比较有特色的实验鱼类。如中国科学院生态环境研究中心选择的泥鳅［19］，广州中山大学和华东师范大学选择的鲫鱼［20］等。同时，本实验室也尝试选择高背鲫鱼作为实验鱼类，对其进行实验室模拟暴露，并与滇池网箱放养结合起来研究外源性雌激素(EE2)和内源性雌激素(E2)的单一及混合雌激素效应。高背鲫鱼是滇池特有的土著鱼类，也是滇池主要的捕捞对象。该鱼适应性强，生长快，性成熟早，繁殖能力强，并以雌核发育生殖方式繁殖后代。因此选择具有滇池特色的高背鲫鱼作为实验鱼类，对开展滇池水环境中雌激素物质的生物效应研究具有重要意义。

2 暴露系统

暴露途径主要有水体暴露、喂食和体内注射三种。其中水体暴露因最接近鱼类的自然生存方式而成为最常用的暴露方法。水体暴露分为静水暴露、半静水暴露和流水式暴露。在进行鱼类暴露实验时，若使用静水或半静水会对鱼类的生长和繁殖产生较大的影响，特别是进行长期的暴露实验，其结果在很大程度上受到置疑，因此在对鱼类进行环境雌激素实验室暴露时，应选择流水式暴露系统以确保其暴露浓度的稳定和精准［21］。

国际上对环境雌激素进行实验室模拟暴露的科研机构大部分采用流水式暴露系统，但目前对于这一系统并没有可参考的规范，一般都是各个实验室根据自己的实际情况自行设计制作。图1是目前应用最为广泛的流水式暴露系统示意图。它主要包括进水处理系统、暴露物处理系统、混合系统、暴露系统、光照系统、出水处理系统及水管系统等［22］。

进水处理系统:自来水经活性炭吸附处理后进入贮水池，贮水池中包括控温棒、增氧曝气装置。对自来水进行曝气增氧及适当加温，通过蠕动泵或玻璃转子流量计来控制其流速后进入混匀器，为整个暴露系统提供新鲜水。实验中需监测的水质指标包括:pH、硬度、溶解氧、温度、余氯含量、氨含量、电导率等。

图1 流水式暴露系统示意图Fig.1 Schematic diagram of a flow－through exposure system

暴露物处理系统:配置好浓度的暴露物储备液经注射泵供应到混匀器中。多通道的注射泵拥有多个玻璃注射器，可装入不同暴露物或不同浓度的同一暴露物，方便进行多种浓度及物质的暴露研究。

混合系统:经进水处理系统处理过的自来水和暴露物质同时加到混匀器中，通过磁力搅拌器将两者充分混匀后注入暴露缸，或依靠物理紊流混匀，无需动力。

暴露系统:由鱼缸和出水管组成。鱼缸采用一次成型的玻璃缸或不锈钢水箱，出水管在避免鱼随水流出的同时，保证了整个系统的正常流通。

光照系统:该系统由日光灯和电子定时器组成，通过设定照明和关闭的时间来控制暴露系统的光照周期。

出水处理系统:为减少实验过程中对环境的污染，出水不能直接排入下水道，而应先经过活性炭处理后再排出。

水管系统:整个系统的水管均为不锈钢水管，保证实验过程中背景化学品溶出量的减少。

3 暴露方式

环境中存在着大量的环境雌激素，在了解单种环境雌激素的雌激素活性同时，还需联系实际环境研究多种环境雌激素的相互作用及作用的方式，因此在实验室模拟暴露中环境雌激素暴露分为单一暴露和混合暴露这两种暴露方式。

3.1 单一暴露

单一暴露是只选择一种环境雌激素，设定不同的浓度来对实验鱼类进行实验室暴露研究。单一环境雌激素暴露可以对单种环境雌激素在实验鱼类内的雌激素活性及其作用机制进行详细深入的研究，能获得单种环境雌激素的毒理学数据。对于环境雌激素的研究而言，单一暴露是基础和必要的。目前，关于单一环境雌激素实验室模拟暴露的报道非常多，主要集中在炔雌醇、烷基酚和双酚A等化合物的研究。

3.2 混合暴露

混合暴露是两种或两种以上的环境雌激素，同样设定多种浓度对实验鱼类进行实验室暴露实验。与单一暴露相比，混合暴露更注重雌激素之间的相关作用［23］。在实际的环境体系中存在着多种具有不同雌激素活性的化合物，基于单种物质的毒理学数据很难正确评估其生态效应及风险，因此研究混合雌激素活性比研究单一雌激素更符合实际环境所存在的状态。

周密详尽的暴露实验设计可最大限度地获得可靠的暴露结果，有助于揭示环境雌激素对实验鱼类产生的一系列雌激素效应。因此在选择好适宜的实验鱼类和暴露方式后，还需确定好暴露物质的浓度分组、在实验中除暴露实验组外还需要设立对照组(溶剂对照和空白对照)和平行组，从而提高实验结果的可靠性。同时实验鱼类生命阶段(生命早期阶段、性分化阶段、未成熟阶段、成熟阶段、繁殖阶段和整个生命周期)的选择也决定了整个暴露研究的结果.

4 评价指标

在环境雌激素对鱼类实验室模拟暴露后，我们可以在分子、细胞、组织、个体及种群水平等多方面来表征环境雌激素的暴露及效应的生化、生理、行为或能量上的变化。评价指标包括行为观察;死亡率、生长率;各组织中环境雌激素的浓度及生物富集因子;性腺指数(GSI)和肝脏指数(HSI);血清中卵黄蛋白原含量(Vtg);鱼鳃、性腺、肝、肾等靶器官的病理学变化;繁殖指标等。

4.1 脏器系数

通过检测实验鱼类的脏器系数可获得靶器官病理性增长或萎缩的信息，有助于初步判断环境雌激素在生物体内的作用位点，并能为深入研究其雌激素效应提供信息。脏器系数一般包括性腺指数(gonadosomatic index，GSI)和肝脏指数(hepatosomatic index，HSI)。它们分别是将性腺或肝脏的质量与鱼体总质量的比值乘以100而获得的值。Scholz等［24］发现在10 ng/L和100 ng/L EE2实验室模拟暴露中，青鳉的GSI显著小于空白对照组，该结果表明青鳉性腺发育受到了抑制，EE2对青鳉的性腺存在较强毒性作用。Zha等［25］发现，在10 μg/L、30 μg/L NP和1 ng/L EE2处理组中，雄性稀有鮈鲫的GSI显著高于空白对照组，而雌性稀有鮈鲫的GSI值只有在5 ng/L和25 ng/L EE2处理组中才明显下降，结果表明当GSI作为测试终点时，雄性稀有鮈鲫对NP和EE2的暴露较雌性更为敏感。此外，该研究还指出稀有鮈鲫的HSI值并不随NP和EE2浓度的增大而表现出明显变化趋势。性腺指数和肝脏指数在实验室模拟暴露研究中并不难获得，而且他们都能较灵敏地反映环境雌激素对鱼体的长期作用效应，因此大部分的相关研究都将脏器指数作为评估雌激素效应的灵敏指标之一。

4.2 卵黄蛋白原含量

卵黄蛋白原(vitellogenin，Vtg)是一种理想的雌激素或类雌激素效应的生物标志物［26］。正常情况下，雄鱼体内没有卵黄蛋白原，只有发育成熟的雌鱼才能产生卵黄蛋白原，但是雄鱼在外源雌激素的暴露下能够诱导产生卵黄蛋白原。因此通过检测实验鱼类血浆、肝组织或整体匀浆中卵黄蛋白原的含量，可以明确指示出环境雌激素的暴露状况。同时，其含量的改变还是众多组织病理学及生殖效应变化的直接原因。卵黄蛋白原的分析检测方法包括免疫杂交分析、放射性免疫分析、酶联免疫吸附法及间接指示法等，其中酶联免疫法(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)目前被较多用于卵黄蛋白原含量的检测［27］。在众多天然和人工合成的雌激素物质中，EE2、E2、BPA、NP和OP受到了人们较多的关注。在大量的实验室模拟暴露研究中发现，EE2、E2和E1具有很强的雌激素活性，在很低的浓度下就能诱导雄鱼和幼鱼体内产生Vtg［28］;而BPA、NP和OP是具有弱雌激素活性的环境雌激素，他们在一定浓度下也会诱导Vtg的产生［13，16］。Thorpe等［17］的研究表明，经14d的暴露，EE2、E2和E1均能诱导虹鳟幼鱼体内Vtg水平的显著性升高，根据剂量－效应曲线计算出EE2、E2和E1的半数有效浓度分别为0.95、26和60 ng/L，由此看出这三种雌激素的活性大小顺序为EE2＞E2＞E1。卵黄蛋白原(Vtg)作为一个重要的雌激素生物标志物，具有特异性和灵敏度高等特点，在环境雌激素的研究方面显示出了独有的优势。

4.3 组织病理学

组织病理学是环境雌激素研究中使用频率较高的评价指标之一，根据鱼鳃、性腺、肝脏、肾脏等组织切片的观察结果能反映出各组织的的病理学变化。Zha等［25］曾报道稀有鮈鲫在5 ng/L和25 ng/L EE2处理组暴露28d后，肝脏出现了严重的损伤，出现肝细胞细胞核增加和肝细胞肥大等现象;Schwaiger等［29］设计了一系列NP和EE2浓度对鲤鱼进行实验室暴露，研究这两种环境雌激素对肝脏和肾脏的组织的影响。发现NP不会引起任何组织的损伤，而任意EE2处理组中鲤鱼的肾脏、肝脏组织都出现了严重损伤，包括肝细胞肥大、细胞核变形;肾小管中嗜曙红物质的积累、肾小管上皮细胞的肥大和坏死。Lange等［10］对黑头软口鲦进行实验室长期模拟暴露研究，在4 ng/L EE2处理组暴露305d后，雄鱼完全雌性化，精巢全部处于精卵共存状态。肾脏在该浓度暴露后出现了大量的嗜曙红物质，上皮细胞出现严重损伤甚至坏死;在高剂量的EE2和NP处理组中还发现了精卵共存现象。

4.4 繁殖指标

鱼类的整个繁殖过程都是在雌激素调节作用下进行的，因此，环境雌激素对鱼类正常生殖活动的影响是实验室模拟暴露实验研究的重要内容之一。通常是通过生殖力、繁殖行为、受精率、孵化率、子代存活率及畸形率等评价指标来检测环境雌激素对鱼类繁殖过程的影响。环境雌激素对鱼类繁殖的影响在众多实验室暴露研究中得到了证实。Paw lowski等［11］在实验室对性成熟的黑头软口鲦进行乙炔基雌二醇暴露，在浓度为10 ng/L和100 ng/L EE2下，其产卵数、受精率明显下降;Xu等［28］发现长期暴露在EE2中的斑马鱼，产卵量和受精率不高，精子活力明显下降;Zha等［30］对稀有鮈鲫的实验室暴露研究表明了EE2对其子代存活率、畸形率、性别比例的显著影响。

5 结语

从国内外众多实验室的暴露研究来看，选择合适的鱼类实验动物，建立完善的流水式暴露系统，寻找灵敏的评价指标是目前进行环境雌激素实验室研究的主要手段。而我国有关环境雌激素的研究起步相对较晚，有关生态毒理学方面的研究还相对较少，因此，开发和研究合适的实验室模拟暴露研究方法将成为我国环境雌激素研究学者的当务之急。此外，为反映实际环境中雌激素的污染的真实状况，还应捕捞野外水环境中的鱼类进行污染物的检测，或将鱼类放进野外水环境或污水处理厂出水口进行网箱放养。因此，如何将环境雌激素的实验室研究与野外环境研究结合起来将是下一步研究的难点和热点。

［1］Soto AM，Sonnenschein C，Chung KL，et al.The e－screen assay as a tool to identify estrogens—an update on estrogenic environmental pollutants［J］.Environ Health Perspe，1995，103:113－122.

［2］Hulka BS，Liu ET，Lininger RA.Steroid－hormones and risk of breast cancer［J］.Cancer，1994，74(3):1111－1124.

［3］Tyler CR，Jobling S，Sumpter JP.Endocrine disruption in wild life:A critical review of the evidence［J］.Cri Rev Toxicol，1998，28(4):319－361.

［4］Severi G，Morris HA，Macinnis RJ，et al.Circulating steroid hormones and the risk of prostate cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2006，15(1):86－91.

［5］Jobling S，Nolan M，Tyler CR，et al.W idespread sexual disruption in wild fish［J］.Environ Sci Technol，1998，32 (17):2498－2506.

［6］Mills LJ，Chichester C.Review of evidence:Are endocrinedisrupting chemicals in the aquatic environment impacting fish populations?［J］.Sci Total Environ，2005，343(1－3):1－34.

［7］Patyna PJ，Davi RA，Parkerton TF，et al.A proposed multigeneration protocol for Japanese medaka(Oryzias latipes)to evaluate effects of endocrine disrupters［J］.Sci Total Environ，1999，233(1－3):211－220.

［8］Nim rod AC，Benson WH.Reproduction and development of Japanese medaka following an early life stage exposure to xenoestrogens［J］.Aquatic Toxicol，1998，44(1－2):141－156.

［9］Kahl MD，Jensen KM，Korte JJ，et al.Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow［J］.J Fish Biol，2001，59(3):515－523.

［10］Lange R，Hutchinson TH，Croudace CP，et al.Effects of the synthetic estrogen 17 alpha－ethinylestradiol on the life－cycle of the fathead minnow(Pimephales promelas)［J］.Environ Toxicol Chem，2001，20(6):1216－1227.

［11］Pawlowski S，Vanaerle R，Tyler CR，et al.Effects of 17 alphaethinylestradiol in a fathead minnow(Pimephales promelas) gonadal recrudescence assay［J］.Ecotoxicol Environ Safety，2004，57(3):330－345.

［12］Orn S，Holbech H，Madsen TH，et al.Gonad development and vitellogenin production in zebrafish(Danio rerio)exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone［J］.Aquatic Toxicolo，2003，65(4):397－411.

［13］Segner H，Caroll K，Fenske M，et al.Identification of endocrine－disrupting effects in aquatic vertebrates and invertebrates:report from the European IDEA project［J］. Ecotoxicol Environ Safety，2003，54(3):302－314.

［14］van den Belt K，Verheyen R，W itters H.Effects of 17 alphaethynylestradiol in a partial life－cycle test with zebrafish(Danio rerio):effects on growth，gonads and female reproductive success［J］.Sci Total Environ，2003，309(1－3):127－137.

［15］马陶武，王子健.一种潜在的鱼类模型动物与内分泌干扰物生物毒性测试研究［J］.环境科学学报，2005，25(2):135－140.

［16］Ackermann GE，Schwaiger J，Negele RD，et al.Effects of longterm nonylphenol exposure on gonadal development and biomarkers of estrogenicity in juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)［J］.Aquatic Toxicol，2002，60(3－4):203－221.

［17］Thorpe KL，Cummings RI，Hutchinson TH，et al.Relative potencies and combination effects of steroidal estrogens in fish［J］.Environ Sci Technol，2003，37(6):1142－1149.

［18］周永欣，成水平，胡炜，等.稀有鮈鲫—一种新的鱼类毒性实验材料［J］.动物学研究，1995，16(1):59－63.

［19］Lv XF，Shao J，Song MY，et al.Vitellogenic effects of 17βestradiol in male Chinese loach(Misgurnus anguillicaudatus)［J］.Comp Biochem Physiol，2006，143(1):127－133.

［20］周忠良，李康，于静，等.壬基酚对鲫鱼(Carassius auratus)的雌激素效应研究［J］.环境科学研究，2004，17(3):60－62.

［21］吕雪飞.卵黄蛋白原在环境内分泌干扰物研究中的应用［D］.北京:中国科学院，2007.

［22］査金苗.鱼类实验动物建立与环境内分泌干扰物长期慢性毒性机理的研究)［D］.北京:中国科学院，2005.

［23］Schubert S，Peter A，Burki R，et al.Sensitivity of brown trout reproduction to long－term estrogenic exposure［J］.Aquatic Toxicol，2008，90(1):65－72.

［24］Scholz S，Gutzeit HO.17－α－ethinylestradiol affects reproduction，sexual differentiation and aromatase gene expression of the medaka(Oryzias latipes)［J］.Aquatic Toxicol，2000，50(4): 363－373.

［25］Zha JM，Wang ZJ，Wang N，et al.Histological alternation and vitellogenin induction in adult rare minnow(Gobiocypris rarus) after exposure to ethynylestradiol and nonylphenol［J］. Chemosphere，2007，66(3):488－495.

［26］Sumpter JP，Jobling S.Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment［J］.Environ Health Persp，1995，103:173－178.

［27］Navas JM，Segner H.Vitellogenin synthesis in primary cultures of fish liver cells as endpoint for in vitro screening of the(anti) estrogenic activity of chemical substances［J］.Aquatic Toxicol，2006，80(1):1－22.

［28］Xu H，Yang J，Wang YX，et al.Exposure to 17 alphaethynylestradiol impairs reproductive functions of both male and female zebrafish(Danio rerio)［J］.Aquatic Toxicol，2008，88 (1):1－8.

［29］Schwaiger J，Spieser OH，Bauer C，et al.Chronic toxicity of nonylphenol and ethinylestradiol:haematological and histopathological effects in juvenile common carp(Cyprinus carpio)［J］.Aquatic Toxicol，2000，51(1):69－78.

［30］Zha JM，Sun LW，Zhou YQ，et al.Assessment of 17αethinylestradiol effects and underlying mechanisms in a continuous，multigeneration exposure of the Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus)［J］.Toxicol App l Pharmacol，2008，226 (3):298－308.

Research M ethod on Laboratory Exposure of Environm ental Estrogens

LIU Jing－liang，PAN Xue－jun*，HUANG Bin，FANG Kai，GAO Jiang－pei
(Faculty of Environmental Science and Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming，Yunnan Province，650093，China)

In this paper，the methods of laboratory studies on fish exposure to environmental estrogens were reviewed，which included experimental fish，exposure mode，exposure system and endpoints.The good design of laboratory exposure experiments would provide theoretical basis and experimental guideline for the study on the exposure mechanism，toxicity and estrogenic effect of environmental estrogens.

Environmental estrogens;Experimental fish;Laboratory exposure;Endpoint

Q95－33

A

1005－4847(2010)04－0355－05

2009－10－26

国家环保公益性行业科研专项基金(200809136);国家自然科学基金(20767002);教育部留学回国人员科研启动基金(教外司留［2008］890号);云南省自然科学基金(2007B035M)。

刘晶靓(1985－)，女，博士研究生，研究方向:环境雌激素生物效应。Email:liujingjing85@yahoo.com.cn

潘学军，教授，博士生导师，研究方向:环境内分泌干扰物。Email:xjpan@kmust.edu.cn