模拟HIV性传播特点的SIVmac239恒河猴直肠黏膜感染

刘浩，刘强，丛喆，王卫，乔红伟，陈志伟，魏强

(1.中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021; 2.香港大学李嘉诚医学院艾滋病研究所，香港 999077)

研究报告

模拟HIV性传播特点的SIVmac239恒河猴直肠黏膜感染

刘浩1，刘强1，丛喆1，王卫1，乔红伟1，陈志伟2，魏强1

(1.中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021; 2.香港大学李嘉诚医学院艾滋病研究所，香港 999077)

目的制备SIVmac239恒河猴(Macaca mulatta)细胞适应株病毒，模拟HIV性传播感染特点进行恒河猴直肠黏膜感染研究，探索引起系统性感染的病毒阈值水平与机体病毒、免疫学之间相关性，为我国艾滋病黏膜疫苗等生物制剂有效性评价提供新的模型构建思路。方法参照HIV性传播自然感染剂量范围，选用SIVmac239连续升高的3种剂量直肠黏膜途径感染两只恒河猴，采取多种方法进行病毒血症和免疫反应特点分析。结果两只恒河猴经2×101TCID50和2×102TCID50病毒滴度2次攻击后45 d，经检测均未建立系统性感染，病毒特异性免疫反应均为阴性;第3次2×103TCID50病毒滴度攻击后，M 296猴表现出典型的系统性感染特点，并诱导特异性免疫反应。结论确认了HIV性传播过程中的病毒剂量效应关系，为预防性生物制剂的猴体有效性评价提供了新的思路。同时，发现SIVmac239 Gag区特异性的T细胞免疫反应在病毒控制过程中发挥了关键作用，对于新一代艾滋病黏膜疫苗的抗原选择具有指导性意义。

SIVmac239;恒河猴;直肠黏膜感染;细胞免疫应答

近年来，我国艾滋病流行形势和特点发生了很大改变。2007年数据显示，性传播已经成为最主要的传播途径。严峻的流行形式和流行特点迫切需要研制出安全有效的艾滋病黏膜疫苗。随着艾滋病感染机制的深入研究，提倡建立模拟自然感染方式的动物模型进行候选疫苗的安全性、有效性以及免疫策略评价。因此，进行模拟HIV性传播特点的恒河猴直肠黏膜感染研究显得非常迫切和重要。本文用致病性SIVmac239细胞适应株不同剂量经直肠黏膜途径连续接种恒河猴，在方法学探索研究的基础上分析SIVmac239细胞适应株在恒河猴直肠感染过程中的剂量效应关系、以及感染模型病毒学、免疫学以及病理学等方面的变化特点，为今后利用此黏膜模型进行艾滋病早期感染和发病机制以及疫苗和杀微生物剂有效性评价等研究提供相关实验数据。

1 材料和方法

1.1 SIVm ac239细胞适应株制备

SIVmac239毒株由美国Aaron Diamond艾滋病研究中心Marx博士惠赠。首先用Ficoll－paqueTMPlus(GE Healthcare，10027342)密度梯度离心法分离正常恒河猴外周血单核淋巴细胞(PBMCs)，然后用CD8 M icroBead kit no human primate(M iltenyi Biotec，5090408090)和MACS Separation Columns (Miltenyi Biotec，130－042－901)进行CD8+T细胞阴选敲除，经过SEB(0.5μg/m L)刺激3 d后，接种SIVmac239毒株，5%CO237℃培养。每隔3 d收集病毒上清液，“HIV－1 Antigen Microelisa system”(BioMerieux，284033)测定P24抗原浓度大于1 ng/ m L时收集病毒并于液氮保存。用TZM－bl方法测定病毒TCID［1］50。同时，利用病毒RNA Env区(M33262，6 846～8 481 bp，共1 636 bp)序列分析的方法分析毒株在制备过程中的变异［2］。

1.2 实验动物

健康恒河猴2只，编号为M296和M546，购自北京协尔鑫公司［SCXK(京)2005－2005］。体重5 kg左右。经间接免疫荧光法(IFA)检测排除相关慢病毒(SIV、SRV－1，2，5、STLV－1)感染。猴免疫缺陷病毒(SIV)易感性密切相关的4种基因(Mamu－A*01、Mamu－A*02、Mamu－B*08、Mamu－B*17)筛查结果为阴性［3］。动物饲养及相关实验在动物BSL－3实验室(许可证号:CNAS BL0010)中进行。

1.3 SIVm ac239感染途径及剂量

SIVmac239病毒原液用无血清RPM I1640培养液稀释，采用剂量10倍连续提高(2×101TCID50起始，剂量1 m L，间隔3周)的攻毒方案，感染期间进行密集采样检测，直至至少一只恒河猴建立系统性感染为止。攻毒过程中恒河猴俯卧位，保证直肠黏膜充分暴露的情况下缓慢将病毒稀释液注入肛窦处，保持俯卧位半小时。

1.4 外周血单核淋巴细胞(PBM Cs)中前病毒DNA的检测

用QIAamp DNA blood minikit(Qiagen，51106)提取外周血基因组DNA，巢式PCR特异扩增外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)中前病毒DNA，目的片段为Gag区312～788 bp(EU280806.2)，共477 bp［4］。

1.5 外周血病毒载量的测定

RNeasy m ini kit(Qiagen，74106)提取血浆中病毒RNA，Quantitect probe RT－PCR kit(Qiagen，204443)Roche LightCycler荧光定量仪测定血浆病毒RNA载量，该方法灵敏性为103copies/m L［5］。

1.6 外周血CD4+/CD8+值的测定

CD3－PerCP(BD，552851)、CD4－FITC(BD，550628)CD8－PE(BD，557086)抗体标记全血中淋巴细胞，流式细胞仪(Calibur FACS)测定CD4+/ CD8+比值［6］。

1.7 外周血总结合抗体滴度测定

恒河猴血浆样品从1∶2开始2倍连续稀释后，用“人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)”(生物梅里埃，A4 4284018－86)检测交叉性体液免疫反应，高于Cut－off值的最大血浆稀释度定义为SIV特异性总结合抗体滴度［7］。

1.8 ELISPOT方法测定淋巴细胞免疫反应

用Monkey IFN－r ELISPOT Kit(U－Cytech，CT126－PR20)检测针对SIV肽库的IFN－r分泌性ELISPOT反应，肽库为NIH提供的SIVmac239肽库Gag(item#6204)、Env(item#6883)、Pol(item# 6443)，反应终浓度为1.33 μg/m L［8］。

2 结果

2.1 SIVm ac239细胞适应株制备及测定

2.1.1 SIVmac239细胞适应株制备:收集的猴PBMC中CD8+T细胞敲除率达93%以上。本批制备病毒经过3次PBMCs传代，每代培养上清P24抗原浓度大于50 pg/mL进行传代，整个传代过程中PBMCs生长状态良好，经SEB刺激出现明显的增殖成团现象，未见由于病毒侵染导致的明显病理学改变。在12 d检测P24抗原浓度达到1.02×103pg/ m L后(病毒量达到峰值)，收集病毒液200 m L，每支1 m L，液氮保存，批号为20090523。TZM－bl细胞检测TCID50为2.13×104TCID50/m L。

2.1.2 SIVmac239细胞适应株序列测定: SIVmac239细胞适应株的Env区6210～7846 bp (EU280806.2)的克隆序列通过PubMed(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站BLAST程序分析，发现与SIVmac239(FJ838783)序列相似度为99%。经Env区序列对应的氨基酸序列分析发现V3区顶端四肽没有改变，SIVmac239 CCR5单嗜性没有改变。

2.2 SIVm ac239连续升高3种剂量直肠黏膜途径感染恒河猴实验

2只恒河猴经2×101TCID50和2×102TCID50两次感染45 d后，各项指标检测表明两只恒河猴均未获得系统性感染，经第3次病毒(2×103TCID50)感染后恒河猴的各项指标如下:

2.2.1 SIVmac239感染恒河猴PBMC中前病毒DNA检测:M296猴第1、2次感染前病毒DNA检测结果均为阴性，第3次感染0 d、3 d检测也为阴性;7 d后，开始在外周血单核细胞(PBMCs)中扩增出病毒cDNA(目的片段在500 bp左右)，之后持续阳性。M546在整个病毒感染期检测结果均为阴性(图1)。

注:1～5.M296 0 d，7 d，63 d;M546 0 d，63 d样品;6.阴性对照;7.阳性对照;M.DL2000 DNA marker。图1 SIVmac239感染恒河猴后cDNA PCR检测Note:1－5:M296 0 d，7 d，63 d;M546 0 d，63 d;6:negative control;7:positive control;M.DL2000 DNA marker.Fig.1 The PCR results of the monkeys after SIVmac239 infection.

2.2.2 SIVmac239感染恒河猴外周血病毒载量: M296猴第1、2次感染外周血病毒载量检测结果均为阴性，第3次病毒感染后从第4天开始出现阳性，第14天达到RNA载量峰值(108.3RNA copies/m L plasma)，第18天后载量呈现下降趋势(107.7RNA copies/m L p lasma降至105.5RNA copies/m L plasma)，感染80 d以后维持104copied/mL左右的载量水平(图2 A)。M546猴的血浆病毒载量一直是阴性(图2 B)。

注:A为M296外周血病毒载量情况;B为M546外周血病毒载量情况。图2 SIVmac239感染恒河猴后外周血病毒载量检测Note:A.The viral load in peripheral blood of M296;B.The viral load in peripheral blood of M546Fig.2 The viral load in peripheral blood of Macaca mulata after SIVmac239 virus infection.

2.2.3 SIVmac239感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值:第3次感染SIVmac239前，2只实验猴的CD4+/CD8+比值均大于1，感染10d后，M296猴的CD4+/CD8+比值表现为倒置，感染后18 d达到最低点(0.45)，实验期间内一直维持倒置状态(图3 A)。M546猴CD4+/CD8+比值在感染7 d时出现一过性倒置(0.97)，之后很快恢复到感染前的正常水平(图3B)。

2.2.4 SIVmac239感染恒河猴外周血总结合抗体滴度测定:第3次感染SIVmac239前，2只实验猴的外周血总结合抗体滴度测定均为阴性。M296猴在第3次感染后第25天时开始检测到抗体(滴度为1∶4)，之后抗体水平持续平稳升高，84 d和91d时抗体滴度达到峰值(1∶2048)(图4A)。M546猴在整个感染期抗体检测均为阴性(数据未列出)。

2.2.5 SIVmac239感染恒河猴淋巴细胞免疫反应测定:SIVmac239第3次感染后60 d IFN－r分泌性ELISPOT分析发现，M296诱导针对SIVmac239 Gag区较强的T淋巴细胞免疫反应(1，375 SFC per m illion PBMCs)，针对SIVmac239 Pol和Env区的淋巴细胞免疫反应表现为弱阳性反应(图4B)。而M546则不能成功的诱导出针对这3个基因区的阳性T淋巴细胞免疫反应(数据未列出)。

注:A为M296的CD4+/CD8+比值情况，B为M546的CD4+/CD8+比值情况。图3 SIVmac239感染恒河猴后外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞比值Note:A.The CD4+/CD8+ratio of M296;B.The CD4+/CD8+ratio of M546.Fig.3 The CD4+/CD8+ratio of T lymphocytes in the peripheral blood of Macaca mulata after SIVmac239 infection.

注:A为M296体液免疫反应情况;B为M546细胞免疫反应情况图4 M296猴感染SIVmac239诱导的免疫学反应Note:A.The humoral immunity of M296;B.The cellular immunity of M546.Fig.4 The immune responses in M296 after SIVmac239 infection.

3 讨论

本研究采用磁性细胞分选等技术通过在恒河猴PBMC细胞传代的方法制备了大批量的SIVmac239细胞适应株，并采用了在HIV性传播自然感染范围内剂量连续提高的攻毒方案探索了SIVmac239直肠黏膜感染过程中的病毒剂量效应关系。在建立系统性感染的M296猴T细胞免疫反应分析后，发现针对SIVmac239 Gag区的ELISPOT反应在病毒控制过程中发挥关键作用。

以往的实验数据表明，很多针对来源于印度的恒河猴的SIV/SHIV强毒株，在感染恒河猴时都会表现出毒力下降的特点，这很大程度上限制了恒河猴艾滋病模型在疫苗和杀微生物剂有效性评价方面的应用。针对这个问题，Pal等［9］学者采用将病毒感染恒河猴进行体内毒力复壮的方法来获取致病性强毒株。本实验将SIVmac239在恒河猴PBMCs中进行体外连续传代适应，不仅节约了恒河猴资源，而且也避免了SIVmac239在恒河猴体内的免疫压力下发生变异的问题。最重要的是，SIVmac239细胞适应株获得了更多适合恒河猴感染的表型，这对于中国艾滋病疫苗和药物评价动物模型的建立具有重要意义。

除此之外，本实验采用HIV自然感染范围内攻毒剂量连续提高的方法来探索SIVmac239黏膜感染过程中的病毒剂量效应关系。近几年，很多研究团队在艾滋病生物制剂的猴体评价研究中多采用大剂量单次感染或同等小剂量多次感染恒河猴的黏膜感染模型［10］，本研究根据HIV性传播的特点，针对性设计了在自然感染剂量范围内连续提高(梯度小剂量多次)的攻毒方案，这对于建立最大限度模拟HIV自然感染状态的SIV恒河猴黏膜感染模型将会提供有价值的参考数据和指导意义。同时，本模型研究可能成为现阶段艾滋病疫苗等生物制品有效性评价的几个常用模型策略的有益补充。

自从1983年HIV－1被发现以来，虽然广大研究人员进行了26年的科研攻关，但是至今仍无法成功诱导针对HIV－1的保护性细胞免疫反应和体液免疫反应。因此，很多学者要求加强或深入研究HIV－1感染过程中保护性免疫反应机制。以往很多观点认为病毒Env区是诱导机体产生细胞学免疫反应的关键部位［11］，近年来，虽然有的学者认为病毒Gag区才是诱导机体产生细胞学免疫反应的关键部位［12］，但是双方的意见分歧仍然较大。通过对M296猴ELISOPT结果分析表明，M296能诱导针对SIVmac239 Gag区的较强淋巴细胞免疫反应。这说明，恒河猴进行直肠黏膜途径感染后，SIVmac239 Gag区特异性的细胞免疫反应在病毒控制过程中发挥关键作用，对于新一代艾滋病黏膜疫苗的研制具有指导意义。

综上所述，模拟HIV性传播特点的SIVmac239恒河猴直肠黏膜感染研究，有助于研究HIV自然感染过程中的剂量效应关系与感染机制，丰富了艾滋病预防性生物制剂的猴体有效性评价动物模型，并且对新一代艾滋病黏膜疫苗研制开发提供了参考数据。作为探索性研究，本实验仅感染两只恒河猴，所得实验数据不能完全排除个体差异和未知因素的干扰，仅对HIV自然感染过程中的剂量效应关系进行初步探索性研究，这个问题以及感染机制问题有待于进一步更为深入的研究。

(注:本文中恒河猴均特指产地于中国)。

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Infection of Rhesus M acaques by SIVm ac239 Virus Inoculated Rectally

LIU Hao1，LIU Qiang1，CONG Zhe1，WANG Wei1，QIAO Hong－wei1，CHEN Zhi－wei2，WEI Qiang1
(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China; 2.AIDS Institute，Li Ka Shing Faculty of Medicine，The University of Hong Kong，Hong Kong 999077，China)

ObjectiveSIVmac239 virus was used to infect rhesus monkeys by rectal inoculation to mim ic sexually transmitted HIV infection.M ethods According to the dosage ranges of natural sexual HIV infection，two monkeys were rectally infected with three different serial doses of SIVmac239 virus.Meanwhile，the data of viremia and immune response were analyzed.Results Both two monkeys were negative by RT－PCR and ELISA method detection after serial challenge with 2×101TCID50and 2×102TCID50doses of virus.However，one monkey(M296)infected with 2×103TCID50for the third time established systemic infection and induced high level of humoral and cellular immune responses.ConlusionIn this study the dose－effect relationship on sexual HIV transm ission was confirmed.The SIVmac239 Gag specific cellular immune response has been suggested to play a key role in virus control，indicating the significance of antigen epitope selection for the new generation of mucosal AIDS vaccine.

SIVmac239;Rhesus Macaques;Rectal mucosal infection;Cellular immunity

R512.91

A

1005－4847(2010)02－0100－05

2009－11－03

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2006CB504200);国家十一五科技重大专项课题(2009ZX10004－402);国家自然科学基金资助项目(30870353)。

刘浩，硕士研究生，从事实验动物病毒分子生物学研究工作。

魏强，博士生导师，研究方向:实验动物病毒学。E－mail:weiqiang0430@sohu.com