脑缺血再灌注半暗带细胞凋亡及 Bcl-2/Bax比值的变化及中药干预机制*

薛 茜 邹玉安 赵宝民 杨向方河北北方学院附属第一医院神经内科(张家口 075000)

近年来研究发现脑缺血再灌注损伤后导致的迟发神经元损伤,主要与氧化应激反应、炎症反应及细胞凋亡等有关 ,其中神经细胞凋亡是一种受基因调控的自主性、程序性细胞死亡过程,是脑缺血再灌注损伤的重要环节,而 Bcl-2/Bax比值变化与细胞凋亡调控有关。本研究通过观察大鼠局灶性脑缺血再灌注后缺血半暗带神经细胞凋亡和 Bcl-2/Bax比值的变化及其康脑液Ⅰ号对其的影响,探讨其可能的脑保护作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性 SD(Sprague-Dawley)大鼠 120只 ,体重 (270± 20)g,SPF/U AF级,购自北京大学医学部实验动物科学部,许可证号:SCXK(京 )2006-0008。称重后随机将大鼠分成 4组,每组 30只。①假手术组;②模型组 (缺血再灌组);③盐酸法舒地尔注射液组;④康脑液 1号组。除假手术组外,各组均缺血 2h,再灌 12h、24h、 72h。

1.2 动物模型制备 采用改良 Longa法[1]复制 MCAO模型,大鼠用 7%水合氯醛 (350mg/kg)腹腔注射麻醉,模型组及康脑液 1号组插入深度为(20±0.5)mm;假手术组麻醉同上,颈部切口暴露颈外动脉,不插线。动物清醒后采用 Longa评分标准进行神经功能评分(0分:无神经功能缺损表现;1分:对侧前爪不能充分伸展;2分:行走时向外侧转圈;3分:行走时向对侧倾斜;4分:不能行走,意识丧失 ),1～3分者纳入实验,不符合模型判断标准的动物剔除。

1.3 药物与试剂 康脑液 1号,由黄芪、三七等 8味中药组成,由河北北方学院附属第一医院中药房煎制。常规煎煮并浓缩至 4g/mL。康脑液 1号采用灌胃法,盐酸法舒地尔注射液采用腹腔注射,均连续给药 7d,每天早晨给药 1次,最后一次给药 1h后实施脑缺血再灌注手术,给药剂量按大鼠与人体表面积等效剂量折算,康脑液 1号组剂量为 3g/100g◦d。假手术组和模型组动物自手术日前 7d开始给予等量去离子水灌胃。观察各组大鼠术毕清醒后的 Longa评分和术后的活动度变化。盐酸法舒地尔注射液(川威):天津红日药业股份有限公司生产(国药准字 H20040356;产品批号:060608;规格 2mL:30mg)。栓线购自北京沙东生物技术有限公司(产品编号 2432-100,线长 40mm,线身直径 0.24mm,头端直径 0.32±0.02mm)。凋亡试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司 (产品批号:10090522)。

1.4 TTC染色及脑梗死面积测定 缺血 2h再灌注 24h后,每组随机抽取 6只大鼠,快速断头取出鼠脑,置冰箱(-20℃)内 10 min后,切除嗅脑,取冠状面从前向后均匀切成2mm厚脑片 5～6片,将切片迅速置于 2% TTC溶液 (37℃水浴)中避光条件下染色 30min。正常脑组织染成红色,缺血区呈灰白色 ,界线清晰。4%多聚甲醛固定 24h。数码相机摄片,计算机图像分析,求得 T TC染色两侧正常区与梗死灶的面积。以缺血对侧脑片的面积减去缺血侧 TTC染色正常区的面积求得脑梗死面积。

1.5 动物灌注固定与取材 将实验大鼠缺血 2h,至再灌注所需时间点时,7%水合氯醛腹腔注射麻醉,常规从主动脉灌注 4%多聚甲醛 150mL固定 30min。快速断头取脑,从前向后将脑组织分为 A、B、C、D、E五等分,切成厚度约 2～3mm厚的脑片,选取 C脑片,入 4%多聚甲醛固定液中继续固定 24 h。

1.6 切片制备及 HE染色 常规乙醇脱水、二甲苯透明,石蜡包埋,切片厚度 5μm,4℃储存备用。 HE染色观察病理形态。

1.7 脑神经细胞凋亡检测 采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的地高辛 dUT P缺口末端标记法 (TUNEL)来识别凋亡细胞。试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司(产品批号:10090522)。

1.8 Bcl-2/Bax比值测定 SP法检测,阴性对照用 0.01mol/L PBS(pH7.4)代替一抗。免疫组织化学法采用 SP法,操作严格按说明书进行,DAB显色,常规脱水、透明、封片。抗体及试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司(PV-6001批号:K92708D)。抗体稀释液:ZL1-9029批号:546892A。

2 结 果

2.1 神经行为学评分及脑梗死体积 大鼠M CAO术后多于 1.5h内清醒。假手术组大鼠活动度大。模型组术后精神较差,反应迟钝,蜷缩扎堆,24h后仍然有蜷缩扎堆现象。康脑液 1号组和盐酸法舒地尔组的状态有一定好转,活动度较大,无扎堆蜷缩。术后 2h～24h内神经功能缺损症状较重,Longa评分较高。术后 24h康脑液 1号组和盐酸法舒地尔组 Longa评分低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.01)(表1)。缺血再灌注 6h即可看到明显梗死灶,累及右侧大脑半球基底节区、额顶叶皮层及海马区,随再灌流时间的延长梗死面积百分比逐渐增大,至缺血再灌注 24h时,梗死体积百分比为(43.00±0.68)%。康脑液 1号组为(35.00± 0.37)%。康脑液1号组比模型组梗死面积明显减小(P＜0.05)。

表1 康脑液 1号对缺血再灌注大鼠神经功能行为学评分的影响()

表1 康脑液 1号对缺血再灌注大鼠神经功能行为学评分的影响()

注:与假手术组比较,▲P＜0.05;与模型组比较,△P＜0.05

再灌注后神经功能行为学评分组 别 n2h 24h 48h假手术组 30 0 0 0模型组 30 1.90±0.74▲ 2.10±0.74▲ 2.60±0.52▲盐酸法舒地尔组 30 1.80±0.63 1.90±0.74 2.40±0.52康脑液Ⅰ 号组 301.20± 0.42▲△ 1.30± 0.48▲△ 1.10± 0.32▲△

2.2 组织病理学改变 高倍光镜下,①假手术组:大脑组织结构完整,无梗死灶及水肿。神经细胞、神经胶质细胞未见异常。胞膜、核膜清晰 ,核仁明显。②模型组:缺血第 1d,缺血对侧,细胞形态正常,核仁清楚。缺血侧皮质神经细胞数量明显减少,排列紊乱,组织间隙水肿严重。缺血半暗带明显,神经细胞稍小,形态基本正常;缺血灶中心区神经细胞面积明显缩小,部分细胞呈三角形,胶质细胞固缩。缺血第 7～14d神经细胞、胶质细胞及毛细血管、小血管与周围脑间质的间隙显著增大,间质疏松。病灶中心区随时间延长出现大量液化性坏死灶及囊性变,后期呈网状改变,残存细胞很少。③康脑液 1号组及盐酸法舒地尔组:在各个时间点与模型组相比,神经元形态改变较轻,胞体完整,突起较清楚,基本保持完整。可见尚存的大脑皮质的正常神经元排列结构,且组织间隙水肿较模型组明显减轻,神经元、胶质细胞和血管大量变性坏死等缺血性改变和炎性反应明显轻于模型组。各组病理组织学改变提示大鼠 M CAO模型制备成功。

2.3 大鼠脑缺血半暗带神经细胞凋亡及 Bax/Bcl-2比值变化及其康脑液 1号对其的影响 光镜下(× 400)细胞核内存在棕黄色颗粒者为凋亡细胞。在梗死周边区随机选取 10个互不重叠视野,计算平均数和标准差,计数阳性细胞。各时间点模型组细胞凋亡数及 Bcl-2/Bax比值明显高于假手术组(P＜0.01);与模型组比较,康脑液 1号组、盐酸法舒地尔组均可明显降低缺血后大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡(P＜0.05),而 Bcl-2/Bax比值升高,康脑液 1号组效果尤为显著 (P＜0.01)(表 2、3)。

表2 康脑液 1号对脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡的影响()

表2 康脑液 1号对脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡的影响()

注:与假手术组比较,▲P＜0.05;与模型组比较,△P＜0.05

梗死灶周边神经细胞凋亡数目(个 /400倍视野)组 别 n12h 24h 72h假手术组 30 0.80± 0.42 1.00± 0.67 0.90± 0.57模型组 3037.30± 3.68▲ 51.60± 3.47▲ 7.30± 1.64▲盐酸法舒地尔组 30 29.30±2.75 44.70±7.17 5.50±1.84康脑液 1号组 3015.10± 1.60▲△27.20± 0.79▲△ 4.80± 1.14▲△

表3 康脑液 1号对缺血再灌注大鼠缺血半暗带 Bcl-2/Bax比值的影响()

表3 康脑液 1号对缺血再灌注大鼠缺血半暗带 Bcl-2/Bax比值的影响()

注:与假手术组比较,▲P＜0.05;与模型组比较,△P＜0.05

Bcl-2/Bax比值组 别 n 12h 24h 72h假手术组 30 0.47± 0.30 0.47± 0.30 0.47± 0.30模型组 30 0.49±1.20▲ 0.41±0.16▲ 0.40±1.10▲盐酸法舒地尔组 30 0.52±1.90▲ 0.53±0.24▲ 0.55±0.34▲康脑液Ⅰ 号 B组 300.54± 1.55▲△ 0.57± 1.21▲△ 0.61± 0.19▲△

3 讨 论 研究表明,神经细胞凋亡是缺血性脑损伤后细胞死亡的重要形式[2],缺血半暗带的细胞凋亡与疾病转归相关,细胞凋亡的机制与凋亡基因表达有关,即促凋亡基因和抗凋亡基因。Bcl-2、Bax基因是目前研究较明确的一对在功能上相互对立的凋亡调控基因,细胞是否进入凋亡程序决定于 Bcl-2蛋白和 Bax蛋白的相对值,Bcl-2/Bax的比率改变与神经元凋亡密切相关[3]。

Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡调控蛋白,主要分布于线粒体、内质网和胞核的外膜[4]。Bcl-2蛋白家族根据其作用分为 2类:一类为抗凋亡蛋白,如 Bcl-2蛋白;另一类为促凋亡蛋白,如Bax蛋白。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之间相互拮抗。Bcl-2蛋白能够抑制 Bax蛋白启动的凋亡机制。而 Bax蛋白作为 Bcl-2蛋白家族的促凋亡成员,可以不依赖于激活或抑制其它相关基因而诱导细胞凋亡。

以往研究显示脑缺血后促凋亡蛋白 Bax表达明显增加,且Bax阳性反应位于 TUNEL阳性的细胞内,其时程与空间的分布与 TUNEL阳性神经元一致[5]。Bcl-2/Bax比值的转变,可能调控了神经元的凋亡。研究表明,细胞受刺激后 Bcl-2/Bax的比值越高,细胞存活率越高,细胞凋亡率越低。

本实验研究结果发现缺血再灌注后,缺血再灌注组大鼠神经细胞凋亡数目、Bcl-2/bax比值均明显高于假手术组;Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔注射液对脑缺血再灌注具有很好的改善作用[6],降低凋亡率,升高 Bcl-2/bax比值。本研究显示,康脑液Ⅰ号组可上调脑缺血再灌注诱导的 Bcl-2蛋白表达,同时下调 Bax蛋白表达,使 Bcl-2/Bax比值升高,可能促使 Bax-Bcl-2异源二聚体形成,抑制细胞凋亡。本实验结果显示,经康脑液Ⅰ号治疗后,梗死灶明显减小,脑神经细胞凋亡减少,Bcl-2/Bax比值明显高于缺血再灌注组,说明康脑液Ⅰ号可能通过抑制脑神经细胞凋亡,达到保护缺血半暗带目的,从而起到保护大鼠局灶性脑缺血再灌注的作用。

目前,关于中药复方治疗中风的研究进展迅速,药理研究证实康脑液Ⅰ号组方中单药如黄芪、三七、葛根等具有扩张血管、改善脑血流、改善微循环、降低血液粘度、降低血脂、抑制炎性反应等作用[7]。我们选择方剂康脑液Ⅰ号为临床治疗缺血性脑血管病的经验组方,以黄芪为君药,三七、葛根、天麻、川芎共为臣药 ,佐以钩藤、地龙,同时川芎、地龙又具引药之性 ,二药轻清引上 ,直达病所。黄芪益气升阳,三七活血止血,钩藤熄风镇惊,地龙清热利湿 ,天麻、川芎定风,可能对脑缺血损伤的神经保护、再生作用机制产生多水平、多通道、多靶点的综合效应。

综上所述,康脑液Ⅰ号可明显减少 M CAO模型大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡,其机制可能与提高 Bcl-2/Bax比值有关,可能是其促进神经元的修复及重塑的机制之一。为临床应用康脑液Ⅰ号治疗缺血性脑血管疾病提供了一定的实验依据。

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