猪毛蒿精油对玉米象体内4种解毒酶活力的抑制

尚利娜,袁海滨,2,魏春艳,3,任炳忠

(1.东北师范大学生命科学学院,吉林长春130024; 2.吉林农业大学农学院,吉林长春130118; 3.吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062)

猪毛蒿精油对玉米象体内4种解毒酶活力的抑制

尚利娜1,袁海滨1,2,魏春艳1,3,任炳忠1

(1.东北师范大学生命科学学院,吉林长春130024; 2.吉林农业大学农学院,吉林长春130118; 3.吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062)

植物精油是一种最具潜力的储粮防护剂,对储粮害虫具有多种生物活性并能影响害虫体内酶活力的变化.采用5种质量分数的猪毛蒿精油(1%,5%,10%,15%,20%)分别处理玉米象2,4,8,12,24 h后,测试了玉米象体内4种解毒酶活力的变化情况.结果表明,经猪毛蒿精油触杀后,玉米象体内4种解毒酶的活力发生了变化.酸性磷酸酯酶(ACP)、碱性磷酸酯酶(ALP)和α-乙酸萘酯酶(α-NACarE)活力受到抑制.在低质量分数处理条件下(第Ⅱ至第Ⅳ处理组),谷胱甘肽-S-转移酶被诱导,活性升高;在高质量分数时(第Ⅴ、第Ⅵ处理组),酶的活性受到抑制.本研究的结果为阐明猪毛蒿精油的杀虫机理提供了参考.

精油;猪毛蒿;玉米象;酶活力

玉米象是最具破坏性的储粮害虫之一,常见于家庭、粮仓和仓库内的粮食中[1].多年来,利用化学熏蒸剂和防护剂对玉米象进行防治不仅污染环境而且影响粮食的安全;此外,已有报道表明玉米象对多种杀虫剂,包括磷化氢和马拉硫磷等都产生了抗药性[2-5].因此,迫切需要开发和利用安全的储粮害虫熏蒸剂和防护剂.

猪毛蒿(A rtemisia scopariaWaldst.et Kitag)隶属于菊科(Compositae)、蒿属(A rtemisia),分布于我国各地,容易采收[6].目前已有研究表明从猪毛蒿植株中提取的精油对多种害虫具有触杀、熏蒸和种群抑制的作用.其主要成分茵陈二炔高达42.4%[6],对仓库害虫如赤拟谷盗 Tribolium castaneum Herbst、谷蠹 Rhizopertha dominica(Fabricius)、黄粉甲 Tenebrio molitorL.和麦蛾 Sitotroga cerealella(Oliver)具有显著的繁殖抑制、杀卵和忌避作用[7].同时,还发现茵陈二炔对昆虫具有光活化毒性和酯酶抑制作用[8].但是,对不同质量分数的猪毛蒿精油进入昆虫体内后,虫体内解毒酶变化情况的研究还很有限.

植物精油作用于昆虫的组织和器官中,能够影响多种解毒酶的活力,如α-乙酸萘酯酶(α-NACarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、酸性磷酸酯酶(ACP)和碱性磷酸酯酶(ALP)等.精油在进入昆虫体内以后,有些可能被降解而失活,有些可能被活化而增强毒性.这常常是由于不同酶的催化作用,导致这些酶通过增强对精油的转化和降解作用以降低毒性或通过阻隔作用保护自己的靶标位点,在对外源化合物的解毒代谢和杀虫剂的抗性机制中起着重要作用.本研究测试了5种质量分数的猪毛蒿精油处理玉米象不同时间后,玉米象体内4种解毒酶的活力,旨在了解猪毛蒿精油对玉米象体内酶活力的抑制情况,初步阐明精油的作用机制.

1 材料和方法

1.1 猪毛蒿精油的提取

供试植物猪毛蒿(A.scoparia)于2008年8月末至9月初采自吉林省长春地区.猪毛蒿精油的提取采用蒸馏的方法:取猪毛蒿的种穗阴干后切碎,加水浸泡12 h,每100 g种穗加水约300 mL,蒸馏2.5～ 3 h,冷凝器中不再有油滴滴出表示蒸馏结束.用棕色玻璃容器收集,密闭,置于4℃冰箱内保存备用.试验得到的猪毛蒿精油为黄色且具有刺激性气味的挥发油.

1.2 昆虫饲养

玉米象Sitophilus zeamais(Motschulsky)采自吉林省长春市.在全黑暗(DD),(30±1)℃,相对湿度65%～70%条件下,以大米饲养.将大米分装于玻璃罐内,接入玉米象,7 d后筛去成虫,待新一代成虫大量出现约一周后,筛出成虫供试验用.

1.3 酶源制备

将玉米象置于9 cm培养皿中,每皿接虫30头,用微量点滴器将丙酮及用丙酮配置的5种质量分数的精油点滴于玉米象成虫的背板上,每虫点滴1μL,重复3次.试验共计6组,即Ⅰ:对照组;Ⅱ:1%处理组;Ⅲ:5%处理组;Ⅳ:10%处理组;Ⅴ:15%处理组;Ⅵ:20%处理组.分别取对照和不同质量分数的精油处理不同时间(2,4,8,12,24 h)后的玉米象,放入预先灭菌的5 mL玻璃匀浆器中,加入p H值为7.0的0.1 mol/L磷酸缓冲液2 mL,冰浴匀浆.匀浆液在4℃,12000 r/min条件下离心30 min,取上清液作为酶源.

1.4 磷酸酯酶活力测定

1.4.1 ACP活力测定

参照Bessey的方法[9].反应混合液含有0.2 mol/L醋酸缓冲液(p H=4.6)0.72 mL、30μL酶液、0.0075 mol/L对-硝基磷酸二钠溶液0.15 mL.将混合液混匀后,在37℃水浴中振荡30 min,加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液0.6 mL,终止反应.在400 nm处比色.以对-硝基酚为底物作标准曲线.

1.4.2 ALP活力测定

用0.04 mol/L巴比妥钠-盐酸溶液(p H=9.6)代替0.2 mol/L的醋酸缓冲液,其他试剂及方法均同ACP活力的测定.

1.5 α-NACarE活力测定

参照Asperen的方法[10].反应混合液中含有10μL酶液、0.04 mol/L磷酸缓冲液(p H=7.0)(内含1×10-7mol毒扁豆碱)3.49 mL、0.0004 mol/Lα-乙酸萘酯液0.5 mL,在37℃水浴中保温30 min,加入0.5 mL显色剂(1%固牢蓝BB盐溶液与5%SDS溶液以体积比为2∶5混合),室温下放置10 min, 600 nm比色.以α-萘酚作标准曲线.试验重复三次.

1.6 GSTs活力测定

参照Habig的方法[11].反应混合液含有0.1 mL酶液、66 mmol/L磷酸缓冲液(p H=7.0)2.4 mL、50 mmol/L谷光甘肽溶液0.2 mL、0.03 mol/L 1,2-二氯-4-硝基苯溶液50μL,立即混匀.在27℃, 340 nm光源下检测,测5 min内D(340)值的变化.试验重复三次.

1.7 蛋白质含量测定

以牛血清白蛋白为标准蛋白,参照Bradford的方法测定[12].反应混合液中含有蛋白试剂3 mL,水0.95 mL,蛋白质提取液50μL.室内静止10～20 min,595 nm测吸光值.试验重复三次.

1.8 数据分析

利用SPSS软件分别对不同处理及时间下,各处理组的磷酸酯酶、α-乙酸萘酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活力进行方差分析,各表中同列数据后相同字母表示在0.05水平上差异不显著.

2 结果与分析

2.1 猪毛蒿精油对ACP活力的影响

猪毛蒿精油对玉米象体内ACP活力的影响结果见表1.与对照组Ⅰ相比,在2,4,8 h时,几乎所有处理组的ACP活力均受到抑制,且差异显著;在24 h时,第Ⅱ、第Ⅳ、第Ⅴ处理组的ACP活力显著降低.24 h后,所有处理组的ACP活力逐渐有所恢复.

表1 猪毛蒿精油对玉米象成虫ACP活力的影响

2.2 猪毛蒿精油对ALP活力的影响

从表2可以看出,与对照组Ⅰ相比,在8,12 h时各处理组的ALP活力显著下降;除第Ⅲ处理组,在2 h时,各处理组的ALP活力显著降低;在4 h时,ALP活力显著升高;在24 h时,第Ⅱ至第Ⅳ处理组的ALP活力显著降低.

表2 猪毛蒿精油对玉米象成虫ALP活力的影响

2.3 猪毛蒿精油对α-NACarE活力的影响

从表3中可以看出,与对照组Ⅰ相比,在2,12,24 h时,各处理组的α-NACarE活力差异显著;在4 h时,第Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ处理组的α-NACarE活力显著降低;在8 h时,第Ⅲ至第Ⅵ处理组的α-NACarE活力与对照相比显著升高.

表3 猪毛蒿精油对玉米象成虫α-NACarE活力的影响

2.4 猪毛蒿精油对GSTs的影响

从表4中可以看出,与对照组Ⅰ相比,在2 h时,各处理组的 GSTs活力显著升高;在4 h时,第 Ⅳ至第Ⅵ处理组的GSTs活力显著降低;在8 h时,除第Ⅱ处理组外,各处理组的GSTs活力显著升高;在12 h和24 h时,第Ⅱ至第Ⅳ处理组的GSTs活力与对照相比显著升高.

表4 猪毛蒿精油对玉米象成虫GSTs活力的影响

3 讨论

经猪毛蒿精油触杀后,玉米象体内4种解毒酶的活性发生了变化.磷酸酯酶和羧酸酯酶是昆虫体内重要的解毒酶系之一,在对有机磷化合物的解毒作用中起重要的作用.它们代谢能力的增强能够抵御杀虫剂的攻击,在许多害虫中发现这些酶活性的高低与昆虫对杀虫药剂的敏感性有着密切的关系.许多杀虫药剂能够抑制它们的活性,使其降低对酯类杀虫药剂的降解[13].通过对酸性磷酸酯酶、碱性磷酸酯酶和羧酸酯酶的测试发现,与对照相比,它们活性受到了抑制,这就可能导致虫体不能将精油代谢,从而引发玉米象的中毒或死亡.

谷胱甘肽-S-转移酶是昆虫对杀虫药剂代谢中重要的共扼酶系之一,它催化内源性的GSH反应,对底物进行亲核共扼代谢,特别是许多有机磷化合物能被谷胱甘肽-S-转移酶作用解毒[14].通过对谷胱甘肽-S-转移酶活性的测试发现,在低浓度处理时(第Ⅱ至第Ⅳ处理组),谷胱甘肽-S-转移酶被诱导表现为活性升高,在高浓度处理时(第Ⅴ至第Ⅵ处理组),谷胱甘肽-S-转移酶的活性受到抑制.这种变化反映出低浓度的猪毛蒿精油进入虫体内后,玉米象为了抵抗外源物质,激发了体内谷胱甘肽-S-转移酶的活力,从而达到解毒的作用;而浓度较高的精油进入玉米象体内后,谷胱甘肽-S-转移酶的活性受到抑制,这就可能使玉米象的正常解毒代谢受到抑制,使外源有毒物质在虫体内积累,引起了玉米象的中毒或死亡.

本试验从蛋白质水平上研究了猪毛蒿精油对玉米象体内4种解毒酶活力的影响,至于酶的变化是在表达量上发生改变还是合成了新的同工酶则需要从分子水平上进行深入的研究.

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(责任编辑:方 林)

Inhibition on the activities of detoxification enzymes inSitophilus zeamais of essential oil extracted fromArtemisia scoparia

SHANG Li-na1,YUAN Hai-bin1,2,WEI Chun-yan1,3,REN Bing-zhong1
(1.School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130118,China; 2.Faculty of Agronomy,Jilin Agricultural University,Changchun 130024,China; 3.Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Changchun 130062,China)

Plant essential oil which is proposed as one of the most potential stored grains protectant and repellents has better bioactivity against insects and effect enzymes in their body.The activities of detoxification enzymesinSitophihuszeamais(Motschulsky)whichweretreatedwithfive concentrations gradients(1%,5%,10%,15%and 20%)of essential oil extracted fromA rtemisia scopariaWaldst.et Kitag.were measured at 2,4,8,12 and 24 h.The results showed the activities of phosphatase and carboxylesterase were inhibited.At the lower concentration(fromⅡtoⅣtreatment group),the activity of glutathione-S-transferase was induced to increase;at the higher concentration (from ⅤtoⅥtreatment group),the activity of glutathione-S-transferase was inhibited.This study would help to elucidate the insecticidal mechanisms of essential oil.

essential oil;A rtemisia scoparia;Sitophilus zeamais;enzyme activity

Q 965.9[学科代码]180·5440

A

1000-1832(2010)04-0116-05

2010-04-23

吉林省科技发展计划项目(20090571,20090262);吉林省发改委资助项目[(2007)1033号];国家质检总局资助项目(2008IK253);长春市净月开发区资助项目(2007C010).

尚利娜(1982—),女,博士研究生;通讯作者:任炳忠(1963—),男,博士,教授,博士研究生导师,主要从事昆虫学研究.