白腐菌预处理对粉单竹化学成分和微观纤维形态结构的影响

熊建华程 昊王双飞李可成

(1.广西大学化学化工学院,广西南宁,530004;2.广西工学院生化系,广西柳州,545006;

3.广西大学造纸科学研究所,广西南宁,530004;4.加拿大New Brunswick大学,加拿大弗雷德里克顿,E3B6C2)

白腐菌预处理对粉单竹化学成分和微观纤维形态结构的影响

熊建华1,2,3,4程 昊2王双飞3,＊李可成4

(1.广西大学化学化工学院,广西南宁,530004;2.广西工学院生化系,广西柳州,545006;

3.广西大学造纸科学研究所,广西南宁,530004;4.加拿大New Brunswick大学,加拿大弗雷德里克顿,E3B6C2)

3种白腐菌菌株对粉单竹进行1～4周的生物培养,通过考察竹片在生物预处理后质量损失率、木素去除率、综纤维素损失率、木素降解选择因子的变化,筛选出能够选择性有效去除竹片木素的白腐菌Trametes hirsuta19-6作为研究对象。用显微镜观测粉单竹纤维细胞壁的结构特点,以及白腐菌预处理引起的竹片纤维微观形态结构的变化,探讨白腐菌生物降解竹片的机理。

粉单竹;生物机械制浆;扫描电子显微镜;透射电镜;白腐菌

自然界中有数千种白腐菌可以不同程度地降解木素、纤维素和半纤维素。白腐菌有能力降解纤维细胞的所有成分,包括木素。不同白腐菌对木素、纤维素和半纤维素的降解程度差异很大,很多菌种是没有选择性或有选择性地袭击同一原料的不同区域,从而产生了生物降解过程的不同。不同的菌属对不同类型的材种有不同的作用效果,即使同一菌属的不同白腐菌对纤维细胞成分的生物降解能力差别也很大[1]。

生物制浆需要筛选出能够选择性降解木素的白腐菌,筛选的原则是生长快速而且能够选择性地有效去除木素。最初菌种的筛选是根据原料化学成分的变化来确定木素的去除效率,其优点是能够直观反应木素的降解情况。之前对于白腐菌菌种的筛选和降解机理的研究较多集中在木材纤维原料上,对于非木材纤维原料,国内已有对麦草和蔗渣研究的相关报道[2-4]。竹子作为一种非常重要的非木材纤维原料,在白腐菌预处理的机理和生物制浆领域的研究报道甚少。因此,本研究用生物处理前后化学成分的变化来初步筛选有效预处理竹片的白腐菌,同时,借助显微镜观察生物预处理对竹纤维细胞壁的腐蚀情况,为竹子生物化机浆的研究提供理论依据。

1 实 验

1.1 实验原料

本研究所用的粉单竹产自广西,竹子切片(2 cm× 2 cm×0.2 cm)后在空气中干燥并储存,在生物预处理前,竹片在水中浸泡12 h。本研究采用的3种白腐菌菌株Tram etes hirsute19-6、Tram etes hirsute19-6(w)和P.chrysosporium(Pc-1767)由华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室提供。所有菌株均保存在PDA斜面固体培养基中,菌株特性如下。

Pc-1767主要分泌木素酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)、纤维素酶和半纤维素酶,之前的研究表明Pc-1767最适宜的生长温度为39℃、pH值为4.5[4]。

Tram etes hirsute19-6、Tram etes hirsute19-6(w)是从竹子上分离出的新菌种,它们主要分泌锰过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和半纤维素酶。Tram etes hirsut 19-6为野生白腐菌Tram etes hirsute19-6(w)驯化得到的菌株,其纤维素酶的分泌量低于19-6(w)菌株。白腐菌Tram etes hirsute19-6、Tram etes hirsute19-6(w)最适宜的生长温度为28℃、pH值为4.5[5]。

1.2 竹片的预处理

竹片测定水分后分别在1000 mL的锥形瓶中装入80 g绝干竹片,再加入营养液和无菌水,相对湿度保持在70%～80%。调节初始pH值为4.5,经过高温(121℃,30 min)灭菌后,在无菌条件下转接10 mL悬浮菌丝液。悬浮菌丝液的制备见参考文献[5]。装有白腐菌Tram etes hirsute19-6、Tram etes hirsute19-6(w)的样品在28℃恒温恒湿培养箱中培养,而Pc-1767则在39℃恒温恒湿培养箱中培养。所有样品每天充氧15 min,静置培养1～4周。

1.3 竹片化学成分的测定

竹子原料化学成分的分析方法见参考文献[6]。经白腐菌处理的竹片用蒸馏水浸泡后将表面的菌丝体冲洗掉,自然风干后称量,根据生物预处理前后的质量差计算质量损失率。Klason木素含量根据相关国家标准测定。白腐菌的脱木素能力可用竹片质量损失率、残留木素含量、木素降解选择因子来评估。

竹片质量损失率=(竹片处理前质量-竹片处理后质量)/竹片处理前质量

综纤维素损失率=竹片质量损失率-木素损失率

木素降解选择因子(SF)=木素损失率/综纤维素损失率

1.4 竹片微观纤维形态结构的观测

竹片微观纤维形态结构的观测见参考文献[6]中植物纤维原料生物结构的观察部分。

2 结果与讨论

2.1 粉单竹的化学组成和纤维形态结构

粉单竹的化学组成见表1。由表1可见,粉单竹的纤维素和戊聚糖含量较高,木素含量较低,适合用于生产化机浆和生物化机浆。

表1 粉单竹的化学组成%

通过扫描电镜和透射电镜观察到的粉单竹纤维形态结构如图1～图3所示。由图1可知,粉单竹含有较多的薄壁细胞,细胞壁较薄而细胞腔较大。竹子的表皮细胞组织紧密,细胞壁表面光滑完整,没有任何空洞和凹穴,药液和菌丝都难以从表皮细胞组织渗入。同时薄壁细胞的细胞壁又具有薄的初生壁和厚的次生壁(见图2和图3)。粉单竹的薄壁竹纤维为多层复合结构,多层的次生壁结构中宽层和窄层交替分布,层与层之间还有黑的线条出现,胞间层和细胞角隅结构组织相对疏松。多层的次生壁结构是竹子纤维形态的一个重要特征,早期的研究结果显示,竹子的木素含量主要集中在胞间层、细胞角隅和次生壁的窄层[7-8]。

2.2 白腐菌生物预处理对竹片化学成分的影响

竹片在添加营养液和供氧的条件下用3种菌种分别预处理1～4周,计算出质量损失和残余木素含量,而综纤维素损失和木素降解选择因子可通过木素损失和质量损失计算得出,结果见表2。已有研究证实,聚糖类和木素的降解分别在白腐菌生长的初生和次生阶段发生。当白腐菌在木质纤维原料上繁衍时,首先从菌丝中分泌出纤维素酶和半纤维素酶,降解部分聚糖类以供给真菌生长所需要的营养物,在消耗聚糖类降解产物及生长蔓延的过程中,分泌出一系列木素降解酶,此时生物进入木素降解阶段[4]。

表2 不同白腐菌预处理后竹片化学成分的变化

2.2.1 白腐菌生物预处理对竹片质量损失率的影响

在1～4周的培养过程中,白腐菌Thrametes hirsute19-6预处理的竹片质量损失率为8.53%～12.66%, Trametes hirsute19-6(w)为7.01%～10.07%,Pc-1767为8.08%～8.69%。这说明白腐菌Trametes hirsute19-6预处理带来的质量损失率要高于Trametes hirsute19-6 (w)和Pc-1767。因此,白腐菌种类对竹片质量损失率是有影响的。

随培养时间的延长,质量损失率也相应增加。质量损失率增加的速率在3周后变缓慢,表明白腐菌的生物降解主要发生在早期。前期的研究表明,白腐菌降解木素的同时也伴随着碳水化合物的降解,有些能选择性降解木素的白腐菌在去除大量木素的同时也有少量的纤维素和半纤维素损失,而有些白腐菌则同时去除大量的多糖类物质和木素。因此,质量损失包含木素损失和综纤维素损失。

2.2.2 白腐菌生物预处理对竹片木素去除率的影响

在1～4周的培养过程中,白腐菌Trametes hirsute19-6预处理的竹片木素去除率为16.88%～20.68%, Trametes hirsute19-6(w)为15.04%～19.36%,Pc-1767为12.75%～16.72%。即Tram etes hirsute19-6的木素去除效果最好,同时Tram etes hirsute19-6(w)的木素去除率要高于Pc-1767。白腐菌Tram etes hirsute19-6和Tram etes hirsute19-6(w)与Pc-1767相比,由于增加了漆酶的分泌作用,可能增强了降解竹片木素的活性。由此可见,不同种类的菌种由于分泌的酶不同,对木素去除率的影响很大。

培养周期也同样影响木素的去除率,竹片的木素去除率随培养时间的增加而增加,最大的木素去除率发生在第4周。菌种的脱木素效率在前2周比较高,后2周比较低。其原因可能是前期营养液的消耗减缓了木素降解,也可能是生物降解的产物积聚在一起影响菌种的生长。生物降解的产物包括苯胺、醛类物质以及酸性物质,这些物质会使pH值降低、白腐菌活性钝化。根据Kirk的研究[9],P.chrysosporium菌种在木素降解的最终代谢产物CO2的聚集和氧气含量减少的情况下,相对自然平衡状态下白腐菌的生物降解能力减弱。

日本用筛选的白腐菌phlebia sp.MG-60对蔗渣进行30天的生物预处理,木素去除率达50%以上,而综纤维素的损失率不足10%,认为白腐菌phlebia sp. MG-60能够选择性降解蔗渣木素[10]。Tram etes hir sute19-6在去除20.68%木素的同时只有5.84%的综纤维素损失,因此,可以认为Tram etes hirsute19-6能够选择性降解竹片木素。

2.2.3 白腐菌生物预处理对竹片综纤维素损失率的影响

在1～4周的培养过程中,白腐菌Tram etes hir sute19-6预处理的竹片综纤维素损失率为3.21%～5.84%,Tram etes hirsute19-6(w)为2.35%～3.97%, Pc-1767为3.37%～3.68%。Tram etes hirsute19-6对综纤维素整体的降解能力要高于Tram etes hirsute19-6 (w)和Pc-1767。Pc-1767能选择性降解白杨的木素而只有少量的纤维素损失[11],但Pc-1767对竹片的脱木素效果并不是很有效。

2.2.4 白腐菌生物预处理对木素降解选择因子的影响

白腐菌Tram etes hirsute19-6和Tram etes hirsute19-6 (w)选择性降解木素的选择因子随培养时间增加而降低,而Pc-1767则随培养时间增加而增加。白腐菌Tram etes hirsute19-6和Tram etes hirsute19-6(w)选择性脱木素的选择因子最大值出现在第1周,说明白腐菌Tram etes hirsute19-6和Tram etes hirsute19-6(w)选择性去除木素主要发生在早期,延长培养时间并不能增加选择性脱木素的效率,反而会提高综纤维素损失率,因此,2～3周培养时间对于Tram etes hirsute19-6和Tram etes hirsute19-6(w)来说比较经济合理。先前对于其他菌种的研究也表明延长培养时间并不能提高选择性脱木素的效率。Pc-1767选择性降解木素的选择因子随培养时间的延长从1.20增加到1.58,说明Pc 1767对竹片的脱木素作用需要较长时间的培养,同时也会提高综纤维素损失率。

2.3 白腐菌生物预处理对竹片纤维形态结构的影响

利用电子显微镜能够准确观察白腐菌在植物纤维原料上生长时纤维微观结构的变化,并且已经被证明是研究白腐菌生长方式的一种有效手段。本研究选用白腐菌Tram etes hirsute19-6对竹片预处理2周,观察白腐菌对粉单竹纤维细胞壁的降解情况。

白腐菌降解木素时并不是只发生在纤维细胞壁的某一层或某一特殊的区域,而是贯穿整个细胞壁的所有区域[12-13]。白腐菌降解纤维的路径有两种不同的说法。余惠生发现白腐菌Panus conchatus在降解稻草木素时,它首先攻击木素浓度最高的纤维胞间层,使胞间层的木素迅速降解,然后再逐渐降解其他各层的木素[2]。但大多数的研究表明[14],白腐菌降解木片的路径与化学蒸煮工艺中蒸煮液的渗透路径相似,白腐菌首先进入纤维细胞腔,并迅速占据富含游离糖分和养分的射线细胞(这种辐射排列的射线细胞有利于白腐菌迅速进入木片内部),一旦这些易于摄取的营养物质被消耗殆尽,白腐菌对细胞壁的降解就正式开始,菌丝开始沿着细胞腔壁向胞间层方向逐层地降解木素,最终导致纤维从胞间层分离。

木材的生物腐蚀显示白腐菌的生物降解主要是木素﹑半纤维素和纤维素。生物降解的次序通常与木素和多糖类物质在细胞腔的分布有关。木材纤维的木素主要分布在细胞腔的胞间层和细胞角隅,多糖类物质主要集中在次生壁。能够选择性降解木素的白腐菌主要是降解胞间层和次生壁的木素,留下次生壁的纤维素。通过透射电镜可以看出,白腐菌对竹片的生物降解也是从细胞腔开始。白腐菌首先进入竹片细胞腔内,快速降解含有糖类和营养物质的细胞射线软组织。细胞内射线软组织的排列又使白腐菌在细胞腔内更广泛的分布,并使临近的细胞出现凹穴或是菌丝直接穿过细胞壁向外渗透(见图4),一旦细胞腔内容易被白腐菌吸收的物质耗尽,就开始降解纤维细胞壁。白腐菌通过细胞腔边缘向次生壁和胞间层延伸,进一步攻击纤维细胞的次生壁,使竹片含有复合层状结构的次生壁从内层出现剥离(见图5),整个次生壁开始变薄,细胞组织结构变疏松(见图6)。随着白腐菌对次生壁的降解,白腐菌同时侵袭细胞壁的所有组分,从而使纤维细胞壁不同的层状结构被局部腐蚀,菌丝又穿过细胞壁对胞间层和疏松的细胞角隅进行攻击(见图7)。由于竹片的木素含量主要集中在胞间层、细胞角隅和次生壁的窄层,生物作用的结果使得次生壁、复合胞间层和细胞角隅的部分木素被逐步降解。次生壁首先被分解、变薄,随着脱木素的进行,胞间层被降解的相邻细胞彼此分离。竹片结构的松弛、纤维细胞壁层间发生的分离以及被软化和瓦解的细胞组织有利于化学预处理过程中药品的渗透,从而更有效地降解木素,在磨浆过程中使纤维容易分离且节约能耗。

3 结 论

3.1 从化学组成看,粉单竹具有较高的纤维素和半纤维素含量以及较低的木素和抽出物含量。从纤维形态结构看,粉单竹含有较多的薄壁细胞,细胞壁较薄而细胞腔较大,细胞壁又具有薄的初生壁和厚的次生壁。

3.2 3种白腐菌菌株在各自最佳的培养条件下对粉单竹进行1～4周的预处理,发现在木素降解的同时都伴随着纤维素和半纤维素的降解,但纤维素和半纤维素的降解相比木素少很多。木素去除率和竹片质量损失率随培养时间增加而增大,白腐菌Tram etes hirsute19-6和Tram etes hirsute19-6(w)的木素降解选择因子随培养时间延长而降低,选择性脱木素主要集中在处理早期。3种白腐菌菌株中,Tram etes hirsute19-6生物预处理竹片最有效。

3.3 用透射电镜观测白腐菌Tram etes hirsute19-6预处理2周的粉单竹纤维细胞壁的结构变化,发现白腐菌对竹片的生物降解是从细胞腔开始,从次生壁开始脱除木素,然后延伸到胞间层。

[1] Eriksson K E.Swedish development in biotechnology related to the pulp and paper industry[J].Tappi Journal,1985,68(7):46.

[2] 余惠生.稻草木素生物降解的研究[J].纤维素科学与技术, 1993,76(2):16.

[3] 李建军,詹怀宇.白腐菌预处理制蔗渣生物机械浆[J].纸和造纸,2001,1(2):58.

[4] 高 杨,王双飞.甘蔗渣采用白腐菌生物降解的研究[J].华南理工大学学报,1996,24(12):37.

[5] 熊建华.白腐菌预处理竹子化机浆的研究[D].广西:广西大学,2007.

[6] 石淑兰,何福望.制浆造纸分析与检测[M].北京:中国轻工业出版社,2003.

[7] Parameswaran N,Liese W.On the polylamellate structure of paren chyma wall in Phyllostachys edufis Riv[J]. IAWA Bull,1975:57.

[8] LieseW.Recent Research on Bamboo[C]//Proceedings of the Inter nationalBambooWorkshop.Hangzhon,1986.

[9] Kirk T K.Production ofmultiple ligninases byPhanerochaete chrysos Porium.effect of selected growth condition and use of a mutant strain [J].EnzymeMicrob.Technol.,1986,8(1):27.

[10] Li Xin,Ryuichiro Kondo,Kokki Sakai.Degradation of Biodugar cane bagassewith marine fungusPhlebiasp.MG-60[J].The Japan Wood Research Society,2002,48(2):159.

[11] Masood Akhta.Biomechanical pulpingof aspenwood chipswith thre strains of Ceriporiopsis subvermispora[J].Holzforschung,1994,48 (3):199.

[12] Dunn C,VanWky PW J,Wolfaardt F.Ultrastructure and pulpin of bagasse,treatedwith white-rot fungi[C]//8th International con ference onbiotechnologyinthepulpandpaperindustry. Finland,2001.

[13] Ruel K,Barnoud F.Ultrastructural changes in the wall of spruc tracheids degraded by Sporotrichum Pulverulentum[M].Florida: CRC Press,1980.

[14] AkhtarM,Blanchette R A,Kirk T K.Fungal Delignification and Biomechanical Pulping ofWood[J].Advances in Biochemical En gineering/Biotechnology,1997,57:159.

Abstract:Three white rot fungi were incubated on white powdery bamboo in the opt imum conditions for 1 to 4 weeks,white rot fung Trametes hirsuta19-6 was screened for efficient selective delignification based on the evaluation of bamboo chipsweight loss,lignin removal, holocellulose lose,the factors affecting selective degradation of lignin.Electron microscopeswere used to study the character ofwhite powder bamboo fiber cellwall structure changes brought by fungal pretrea tment.The mechanis m ofwhite-rot fungi attack on bamboo was studied. Keywords:white powdery bamboo;biomechanical pulping;SEM;TEM;white-rot fungi

(责任编辑:田风洲)

Effects of Pretreat ment of Bamboo byW hite-rot Fungi on its Chem ical Composition and FiberM orphology

X IONG Jian-hua1,2,3,4CHENG Hao2WANG Shuang-fei3,＊L I Ke-cheng4
(1.Department of Chem istry and Chem ical Engineering of Guangxi University,Nanning,Guangxi Zhuang Autonom ous Region,530004; 2.Depar tm ent of B iological and Chem ical Engineering,Guangxi University of Technology,Liuzhou,Guangxi Zhuang Autonom ous Region,545006;3.Pulp&Paper Institute of Guangxi University,Nanning,Guangxi Zhuang Autonom ous Region,530004;4.Depar tm ent of Chem ical Engineering and Lim erick Pulp and Paper Centre,University of New B runswick,Fredericton,NB,Canada,E3B6C2)
(＊E-mail:wangsf@gxu.edu.cn)

TS71+2;TS749

A

1000-6842(2010)02-0027-05

2010-02-01(修改稿)

本课题为国家973计划前期研究项目(2006CB708600)资助课题。

熊建华,女;博士;主要研究方向:生物制浆及清洁生产。

＊通信联系人:王双飞,E-mail:wangsf@gxu.edu.cn。