小檗碱对 2型糖尿病 I CR小鼠模型的治疗作用

张玲玲,黄 澜,徐艳峰,李加美,肖 冲,刘 颖,秦 川

(中国医学科学院实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,北京 100021)

研究报告

小檗碱对 2型糖尿病 I CR小鼠模型的治疗作用

张玲玲,黄 澜,徐艳峰,李加美,肖 冲,刘 颖,秦 川

(中国医学科学院实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,北京 100021)

目的比较小檗碱及小檗碱与添加剂对 2型糖尿病 ICR小鼠模型的降糖、降脂效果。方法100只三周龄雄性 ICR小鼠随机分为正常组、模型组、小檗碱组、小檗碱加低剂量添加剂组、小檗碱加高剂量添加剂组及二甲双胍组,以高糖高脂加尿链佐菌素诱导小鼠 2型糖尿病模型,并分别以小檗碱、小檗碱加低剂量添加剂、小檗碱加高剂量每天灌胃干预治疗 6周。检测血糖、血清血脂、肾功指标的变化情况;给药前后做糖耐量胰岛素耐量实验。每周量小鼠体重,动态观察小鼠体重变化。代谢笼中测量小鼠饮食水量变化。结果模型组血糖较普食组显著上升(P<0.01),且维持较好;血脂指标 CHO、HDL-c、LDL-c均较普食组升高 (P<0.05);其他各检测生化指标差异不显著。小檗碱组空腹血糖较模型组总体下降趋势明显且维持较好 (P<0.01);血脂较模型组有降低;糖耐量胰岛素耐量较模型组有改善。二甲双胍组血糖较模型组有下降趋势,血脂较模型组无显著差别。小檗碱加低剂量添加剂组较模型组血糖血脂无显著差别。小檗碱加高剂量添加剂组血糖较模型有下降趋势,血脂较模型组有下降趋势,其他各项生化指标均无差别。结论小檗碱降糖效果优于二甲双胍,小檗碱加低剂量添加剂,小檗碱加高添加剂。

小檗碱;2型糖尿病模型;

2型糖尿病是由于胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足引起碳水化合物、脂肪及蛋白质代谢紊乱的综合征。约占糖尿病人总数的 90%[1]。糖尿病是全球性严重的公共卫生问题,发展迅速,对人类健康危害巨大。近年来,糖尿病及其并发症造成的医疗开支巨幅增长,并给发展中国家带来劳动力的巨大损失。

小檗碱是从黄连、黄柏等中药中提取的具有异喹啉生物碱类药物的主要活性成分。历史悠久,主要作为抗菌素使用,近年研究表明其具有治疗 2型糖尿病的作用,由于其降糖降脂作用明显,药效不易耐受,价格低廉,受到广泛关注。本实验对小檗碱及添加剂降糖降脂效果做一初步观察。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性 ICR小鼠 100只,3周龄,购于军事医学科学院,动物合格证号:0097206,室温 18℃～25℃,相对湿度(30%～70%),每日光照 12 h,自由摄食引水。

1.2 饲料

常规及高糖高脂饲料均由中国医学科学院实验动物研究所提供,高糖高脂饲料在常用的高糖高脂饲料[2-6]配方做部分调整,成分如下:15%猪油, 15%蔗糖,3%胆固醇,1%胆酸盐,0.6%甲基硫氧嘧啶加 66.5%常规饲料。

1.3 实验仪器和试剂

日立 8060全自动生化分析仪,稳豪 One-Touch血糖监测仪,Linco公司的小鼠胰岛素 EL ISA试剂盒。

1.4 实验用药物

小檗碱原料药,批号:200506065,购自东北制药总厂。二甲双胍购自 Sigma公司 (D150959)。尿链佐菌素(STZ)购自 Sigma公司。羧甲基纤维素购自Sigma公司(C0806)。

1.5 动物模型的建立

采用高糖高脂结合尿链佐菌素(STZ)诱导 2型糖尿病小鼠的造模方法[5-7]。简述如下:3周雄性I CR小鼠随机分为普通饮食组(10只)、高糖高脂饮食对照组 (10只)、造模组 (100只,高糖高脂饮食)。喂养五周,测定小鼠空腹餐后血糖并取血、分离血清观查小鼠葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)、总胆固醇 (CHO)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白 (LDL-C)、尿素氮 (BUN)、肌酐(CRE)八项血液生化指标。禁食 12 h后普通饮食组、造模组腹腔一次性注射 STZ(STZ100 mg/kg体重,用 0.1 mol/L无菌柠檬酸钠缓冲液 pH4.5配置, 0.2μm微孔滤膜过滤灭菌)。注射 STZ后继续高糖高脂喂养 6周。取血分离血清测定血糖等上述八项生化指标,并测糖耐量胰岛素耐量。以小鼠空腹血糖≥11,胰岛素耐量异常,糖耐量异常,血脂升高为 2型糖尿病模型判定标准。造模结束时共有糖尿病小鼠 65只。

1.6 分组治疗

糖尿病小鼠 65只随机平均分为模型对照组、小檗碱组 (150 mg/kg)、小檗碱加低剂量添加剂组(150 mg/kg+150 mg/kg)、小檗碱加高剂量添加剂组 (150 mg/kg+300 mg/kg)、二甲双胍组 (250 mg/ kg)五组每天灌胃治疗。小檗碱溶于 1.5%的羧甲基纤维素中。普通饮食对照组和模型组每天 0.2 mL羧甲基纤维素灌胃。灌胃 15周。

1.7 观察指标

1.7.1 口服葡萄糖耐量实验 (OGTT)和糖耐量曲线下面积:小鼠禁食 12 h后,给予葡萄糖 2 g/kg胃,然后在设定时间点 (0、30、60、120、180 min)眼内眦取血测血糖。STZ注射前,给药前,给药实验结束时各测一次。

1.7.2 胰岛素耐量实验:小鼠禁食 4 h后给予胰岛素 0.5 U I/kg,在设定时间点 (0、30、60、90、120 min)眼内龇取血测血糖,STZ注射前,给药前,给药实验结束后各测一次。

1.7.3 血糖及生化指标检测:空腹及餐后血糖采用稳豪血糖仪检测,每两周检测一次。血清胰岛素(F INS)用小鼠 EL ISA试剂盒检测。血生化:采用日立 8060全自动生化分析仪检测血清中葡萄糖(Glu)、总胆固醇 (CHO)、高密度脂蛋白 (HDL-C)、低密度脂蛋白 (LDL-C)、尿素氮 (BUN)、肌酐(CRE)八项指标的变化情况。注射 STZ前、给药前及给药后 6周、9周、12周、15周采血观测。

1.8 病理学

1.8.1 大体观察:安乐动物时,详细观察胰腺、肝脏、脂肪组织、主动脉、肾、心脏、睾丸、坐骨神经、肌肉、淋巴组织、脾、肺、脑、肠胃,等组织的形态学变化。

1.8.2 病理切片制备:安乐动物时,取上述组织中性福尔马林固定,石蜡包埋,常规病理组织切片处理后,H-E染色镜检。

1.8.3 免疫组化:安乐动物时,每只动物取固定部位胰腺中性福尔马林固定,石蜡包埋,常规切片,组织放在涂有多聚赖氨酸的片子上封片,胰岛 A细胞单克隆抗体为一抗,抗鼠 IgG为二抗,二步染色法进行免疫组织化学染色。

1.9 统计学方法

数据以均数 ±标准差表示,使用软件 SPSS15.0对组间差异应用 t检验进行分析。

2 结果

2.1 高糖高脂饮食和小剂量尿链佐菌素对 ICR小鼠血糖血脂影响

模型组空腹血糖 >11,较普食组显著上升 (P< 0.01)且维持较好;血脂指标 CHO,HDL-c,LDL-c均较普食组升高 (P<0.05);其他各检测生化指标差别无统计意义 (表 1);糖耐量实验中峰值较普食组上升 (P<0.01),峰期后延表明糖耐量异常 (图 1);胰岛素耐量实验中谷值较普食组增高 (P<0.01),上升陡峭,表明产生胰岛素耐受(图 1)。

图 1 造模组(高糖高脂饮食 +STZ)STZ注射 5周后葡萄糖耐量实验(a)胰岛素耐量实验(b)Fig.1 Model group(High glucose high fat+STZ)5 weeks after STZ injection glucose tolerance (a)insulin tolerance(b)

表 1 高糖高脂饮食和 STZ注射 5周时对 ICR小鼠血清生化指标的影响Tab.1 The effect of high fat and energy diet and injection of STZ on the blood-serum biochemical indicator

2.2 治疗组血糖血脂及病理改变

空腹血糖动态观测结果显示二甲双胍组,小檗碱组,小檗碱加高剂量添加剂组空腹血糖较模型组均有下降趋势,但二甲双胍组随时间波动较大,小檗碱组总体下降趋势明显且维持较好(P<0.01)(图2);给药 6周血清生化指标显示,模型组较普通饮食对照组血糖上升显著(P<0.01),血脂上升显著(总胆固醇 (P <0.01)、高密度脂蛋白 (P <0.01)、低密度脂蛋白 (P<0.05);小檗碱组、小檗碱加高剂量添加剂组血清血糖较模型组显著降低。小檗碱组、小檗碱加高剂量添加剂组血脂指标总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均较模型组有下降趋势(表 2),糖耐量胰岛素耐量实验显示小檗碱组、小檗碱加高剂量添加剂组较模型组有明显改善(图 3,4)。二甲双胍组血糖较模型组有下降趋势,其他生化指标较模型组无显著差别(表 2)。

图 2 给药实验各组小鼠空腹血糖动态观察Fig.2 Fasting blood of administration groups

2.3 病理改变

模型组肝脏均有脂肪变性,部分出现炎细胞浸润、血管扩张、点状坏死;二甲双胍治疗组肝脏脂肪变性且均有点状坏死病变;小檗碱治疗组肝脏脂肪变性,部分出现炎细胞浸润,点状坏死;小檗碱加低剂量添加剂治疗组仅部分可见脂肪变,少量炎细胞浸润;小檗碱加高剂量添加剂治疗组可见空泡变性(图 5见彩插 6)。肝脏 HE染色结果表明对脂肪肝的改善作用小檗碱及添加剂组优于二甲组,小檗碱加低剂量添加剂组对脂肪肝有明显改善作用效果最好,这也与生化指标中其高密度脂蛋白较模型组有显著改善的结果一致。胰腺 A细胞免疫组化结果可见模型组胰岛内间质细胞明显增多,呈中度增生;二甲双胍治疗组间质细胞轻度增生;小檗碱治疗组间质细胞轻度增生;小檗碱加低剂量添加剂治疗组间质增生显著,呈重度增生。免疫组化结果显示小檗碱组及小檗碱加高剂量治疗组明显对受损胰腺有改善作用且优于二甲双胍治疗组,小檗碱组效果最好,这也与生化血糖检测结果一致(图 6见彩插 7)。

图 3 给药 15周各组糖耐量实验Fig.3 Glucose tolerance after 15-week administration

图 4 给药 15周各组胰岛素耐量实验Fig.4 Insulin tolerance after 15-week administration

表 2 给药 6周后各组生化指标Tab.2 The blood-serum biochemical indicator in six groups after six-week administration

3 讨论

小檗碱作为抗生素使用已有悠久历史,为毛茛科黄连属植物黄连、黄柏的根茎中提取的主要成分,属异喹啉类生物碱。也称黄连素,常用其盐酸盐。研究生人员又发现其有抗心室纤颤,防治心律失常[8];抗血小板聚集[9]的作用。其降糖降脂作用早在 1986年就有报道[10],作为中药,由于其价格低廉,副作用小,近年来又受到中外学者的广泛关注,其降糖作用机制研究主要集在糖脂代谢过程中的几个通路直接降糖或通过调节脂细胞代谢间接降糖几个方面[11,12]。本实验中模型组血糖血脂均明显高于对照组,高糖高脂毒性损伤肝脏胰腺,二者互为因果造成脏器损伤,糖脂代谢紊乱。治疗组中,小檗碱组,小檗碱加高剂量添加剂组降糖效果明显且对高糖及 STZ造成的受损胰腺有明显的改善作用,且效果优于二甲双胍组。但对高脂及其造成的肝脏病变改善并不明显。这表明小檗碱本身具有独立的降糖修复损伤胰腺效果。本实验支持了小檗碱直接降糖而不是通过降脂间接降糖的作用机制。

[1] 史轶蘩.内分泌和代谢学 [M].北京:科学出版社,1999: 1304.

[2] 孙晓风,王海燕,李琳琳,等.高糖高脂饮食诱导的 2型糖尿病模型大鼠血脂特点[J].新疆医科大学学报,2005,28(2): 104-106.

[3] 郭啸华,刘志红,李恒,等.高糖高脂饮食诱导的 2型糖尿病大鼠模型及其肾病特点[J].中国糖尿病杂志,2002,10(5): 290-293.

[4] 沈亚非,徐焱成.高糖高脂膳食和链脲佐菌素诱导 2型糖尿病模型的建立[J].实用诊断与治疗杂志,2006,2O(9):649 -650.

[5] Luo J,Quan J,Tsai J,et al.Nongenetic mouse models of noninsulin-dependent diabetes mellitus[J].Metabolism,1998,47 (6):663-668.

[6] 王彤,汤秀群,赵泳谊,等.链脲佐菌素和高脂肪饲料诱导的实验性 2型糖尿病小鼠模型[J].中国糖尿病杂志,2000,8 (2):111-112.

[7] 李国生,刘栩晗,朱华,等.小檗碱对 2型糖尿病中国地鼠的治疗作用[J].中国比较医学杂志,2007,10(17):559-567.

[8] 黄伟民,干以庆,任建英,等.黄连素治疗室性快速心律失常[J].中华心血管杂志,1990,18(3):155-157.

[9] 储钟禄,姜云飞,王智慧,等.黄连素对血小板聚集和释放的抑制作用[J].第二军医大学学报,1989,10(4):323-324.

[10] 陈其明,谢明智.黄连及小檗碱降血糖作用的研究[J].药学学报,1986,21(6):401-403.

[11] Lee YS,Kim WS,Kim KH,et al.Berberine,a natural plant product,activates AMP-activated protein kinase with beneficial metabolic effects in diabetic and insulin-resistant states[J]. Diabetes,2006,8(55):2256-2264.

[12] Kim SH,Shin EJ,Kim ED,et al.Berberine activates GLUT1-mediated glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes[J].Biol Phar m Bull,2007,30(11):2120-2125.

Therapeutic Effect of Berberine Recipe on ICR M ouseM odel of Type 2 D iabetes

ZHANGLing-ling,HUANGLan,XU Yan-feng,L IJia-mei,X IAO Chong,L IU Ying,Q IN Chuan
(Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Science(CAMS) and PeckingUnionMedical College(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo compare the effectof berberine and additive on serum glucose and lipid level。MethodsType 2 diabetic modelwas induced by both high lipid food and low dose of streptozotocin(STZ)in mice.The number of 100 three month’smice were randomly divided into normal group,type 2 diabetic model group,berberine treated group, berberine and low dose additive treated group,berberine and high dose additive treated group and metfor min treated group. Every group were administered through intragastric administration of berberine,berberine and low dose additive,berberine and high dose additive in sixweeks.The capability of glucose and insulin tolerance wasmeasure.The blood glucose,the serum lipids and the function of kidneywere observed.The weight of mice was monitored every week.Food and drink of the mice were also observed in the metabolic cages。ResultsThe blood glucose level of type 2 diabetic model was obviously higher than that of normal group(P <0.01)and steady.The level of CHO,HDL-c and LDL-c in the blood lipidswere increased,other indexes were not statistical significance.The glucose level of Metformin treated group was decreased,but the blood lipid levelwas no significant difference.The glucose level and blood lipid level of berberine and low dose of additive treated group were no obvious difference.The glucose level of berberine and high dose additive treatedgroup were decreased,but the blood lipid level was no significant difference.Other biochemical indexes showed no difference。Conclusions The medical activities of berberine are better than metfor min,berberine and low dose additive, berberine and high dose additive.

Berberine;Type 2 diabetic model;ICR mouse

R-33

A

1671-7856(2010)01-0023-05

2009-09-15

张玲玲,硕士生,研究方向:2型糖尿病发病与治疗机制研究。E-mail:zhangll821025@163.com

秦川,博士生导师。E-mail:qinchuan@pumc.edu.cn