四氧嘧啶诱发糖尿病模型效果的性别差异

叶华虎,袁菊芳,李 敏,王艳静,董 罡,杨丽萍,张广州,张小飞,曾 林

(军事医学科学院实验动物中心,北京 100071)

研究报告

四氧嘧啶诱发糖尿病模型效果的性别差异

叶华虎,袁菊芳,李 敏,王艳静,董 罡,杨丽萍,张广州,张小飞,曾 林

(军事医学科学院实验动物中心,北京 100071)

目的了解性别因素对四氧嘧啶诱发糖尿病动物模型的影响,为提高动物模型的复制效率提供实验依据。方法分别给雌、雄比格犬和昆明小鼠注射不同剂量的四氧嘧啶,药后 3、7、14、21 d测定血糖值,同时统计实验期间动物的死亡情况。结果给予同等剂量的四氧嘧啶,雌性比雄性动物的血糖升高更快,浓度更高。雌性犬四氧嘧啶的最适造模剂量为 40 mg/kg,而雄性犬在此剂量下的模型成功率只有 40%,二者差异极显著 (70%VS 40%,P<0.01);雄性犬的最适使用剂量为 50 mg/kg,但在此剂量下有高达 30%的雌性犬因高血糖而死亡。四氧嘧啶对小鼠的影响与犬基本一致,雌雄鼠的最佳剂量分别为200 mg/kg和250 mg/kg。结论雌性动物对四氧嘧啶的敏感性较雄性动物高,雄性动物在使用四氧嘧啶复制糖尿病模型时,其剂量通常需要较雌性动物高 20%左右。

四氧嘧啶;糖尿病;模型,动物;血糖

四氧嘧啶是制备糖尿病动物模型的常用药物,其机制是选择性地破坏胰岛β细胞,引起细胞死亡,导致血中胰岛素浓度下降及高血糖产生,形成胰岛素依赖性糖尿病。利用四氧嘧啶制备糖尿病动物模型,已有大量文献报道,对于成模的影响因素 (如饲料成分、给药次数、给药途径、动物体重等)也较为清楚[1-6]。本研究通过四氧嘧啶药物诱发不同性别动物制备糖尿病动物模型的量效关系,阐明四氧嘧啶药物效应的性别差异,为提高诱发糖尿病动物模型效率提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物:比格犬 80只,10～12 kg,雌雄各半;昆明小鼠 120只,18～22 g,雌雄各半。由军事医学科学院实验动物中心提供[I CXK-(军)2007-004]。

1.1.2 试剂:四氧嘧啶 (alloxan),美国 sigma公司产品,临用前用生理盐水配成相应浓度。

1.1.3 仪器:One-touch稳豪型血糖仪和血糖试纸,美国强生公司生产。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与糖尿病模型制备:比格犬分为 8组(雌雄各 4组),每组 10只,分别静脉注射四氧嘧啶 30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg和 60 mg/kg;小鼠8组 (雌雄各 4组),每组 15只,分别腹腔注射四氧嘧啶 150 mg/kg、200 mg/kg、250 mg/kg和 300 mg/ kg。四氧嘧啶在临用前用生理盐水配成 1%的浓度,在注射四氧嘧啶前,动物禁食 12 h。

1.2.2 血糖值测定:各实验组动物在给药前及药后3、7、14、21 d,分别测试空腹血糖值,以第 14天的血糖值≥14.5 mmol/L为模型制备成功,同时统计 21 d内各组动物的死亡数。

1.3 数据处理

2 结果

2.1 雌雄比格犬注射不同剂量四氧嘧啶后的血糖浓度变化

犬注射四氧嘧啶后其血糖值变化见图 1。雌性犬前 3 d为快速上升期,3～7 d为缓慢增长期,7 d达到峰浓度,此后一直在高浓度水平微幅波动 (图1-A),而雄性犬的血糖值增长态势较雌性犬滞后,前 7 d处于快速上升期,峰浓度出现在药后 14 d,较雌性犬推迟约一周(图 1-B)。当使用相同剂量的四氧嘧啶时,雌性犬的血糖值峰浓度明显高于雄性犬(P<0.01)。

图 1 雌雄比格犬注射不同剂量四氧嘧啶后的血糖浓度变化(A为雌性犬,B为雄性犬)Fig.1 Changes of blood glucose concentration in female and male beagle dogs after injected different dose of alloxan (A:female dogs,B:male dogs)

2.2 雌雄比格犬注射不同剂量四氧嘧啶后的模型复制效果

雌性犬注射 40 mg/kg四氧嘧啶,70%(7/10)个体血糖值达到糖尿病模型标准 (≥14.5 mmol/L),当剂量提高到 50 mg/kg时,成模率增加不显著(70%VS80%,P<0.05),而死亡率由 10%上升到30%。雄性犬造模的最适剂量为 50 mg/kg,血糖值达到模型标准的动物占 70%,低于此剂量,成模率偏低 (30 mg/kg、40 mg/kg的成模率分别为 0和20%,),高于此剂量,导致犬死亡增加 (60 mg/kg的死亡率为 20%,且死亡犬血糖值通常在 30 mmol/L以上)(表 1)。

表 1 雌雄比格犬注射不同剂量四氧嘧啶后的模型复制效果Tab.1 Results of diabetic animalmodel induced by alloxan in male and female dogs

2.3 雌雄小鼠注射不同剂量四氧嘧啶后的成模效果

小鼠注射四氧嘧啶后,血糖浓度变化趋势与犬基本相似,雄性小鼠不仅表现血糖值增长滞后,而且其浓度明显低于雌性小鼠(图 2)。就模型复制效果而言,雌性小鼠的最适剂量为 200 mg/kg,此时有80%的动物血糖值达到模型标准,死亡率也较低(6.7%),增加四氧嘧啶剂量为 250 mg/kg时,虽然血糖值进一步升高 (由 16.8 mmol/L～20.7 mmol/L升高到 25.8 mmol/L～29.2mmol/L),但模型复制效率增加不显著 (80%VS86.7%,P>0.05),且有40%的动物先后死亡 (死亡动物的血糖值高于 25 mmol/L)。雄性小鼠的造模剂量以 250 mg/kg最为有利,模型复制效率为 80%,死亡率为 6.7%,与雌性小鼠的 200 mg/kg剂量组结果相似,进一步提高四氧嘧啶注射剂量,死亡动物明显增加(图 2和表 2)。

图 2 雌雄小鼠注射不同剂量四氧嘧啶后的血糖浓度变化(A为雌性鼠,B为雄性鼠)Fig.2 Changes of blood glucose concentration in female and male mice after injected different doses of alloxan (A:female mice,B:male mice)

表 2 雌雄小鼠注射不同剂量四氧嘧啶后的模型复制效果Tab.2 Results of diabetic animalmodel induced by alloxan in male and female mice

3 讨论

四氧嘧啶是胰岛β细胞毒剂,通过产生超氧自由基而破坏β细胞,使细胞内DNA损伤,并激活多聚ADP核糖体合成酶活性,从而使辅酶Ⅰ含量下降,导致mRNA功能受损,β细胞合成前胰岛素减少及胰岛素缺乏[4]。四氧嘧啶糖尿病模型是目前最常用的Ⅰ型糖尿病动物模型之一,模型血糖水平稳定且维持时间长,有明显的糖尿病症状,且模型复制时间短,操作简单,成本较低,是评价糖尿病药物疗效及安全性的常用制模方法[1-6]。

本实验结果显示,四氧嘧啶在雌雄动物中的时-效和量-效关系明显不同。雌性动物在四氧嘧啶注射 7 d后,血糖值即可达到峰浓度,而雄性动物较雌性动物延迟一周,需要 14 d才能达到峰浓度。提示在以四氧嘧啶诱导糖尿病动物模型以及对模型的利用时,为了保持血糖值的稳定性和一致性,提前给雄性动物施与四氧嘧啶不失为一种值得考虑的有效方法。此外,就量-效关系而言,四氧嘧啶在不同性别中的表现也不相同,雌性比格犬静脉注射四氧嘧啶40 mg/kg后,雌性组平均血糖值为 17.6 mmol/L,成模率 (即血糖值≥14.5 mmol/L)和死亡率分别为70%和 10%,而雄性组平均血糖值仅为 11.1 mmol/ L,成模率仅为 40%。当剂量为 50 mg/kg时,雌性组平均血糖值升高到 26.9 mmol/L,成模率提高到80%,但 3只高血糖动物死亡;雄性组平均血糖值为17.1 mmol/L,成模率升高到 70%,且无动物死亡。进一步提高四氧嘧啶的使用剂量,雌雄犬的成模率未见明显升高,反而都出现较高的死亡率。基于动物的血糖值水平、制模成功率和死亡率等指标,我们认为雌雄犬的使用剂量分别以 40 mg/kg和 50 mg/ kg最好。小鼠的实验结果与犬类似,给雌鼠腹腔注射四氧嘧啶 200 mg/kg,血糖值浓度、成模率和死亡率分别为 19.0 mmol/L、80%和 6.7%,效果优于其他剂量组;雄鼠的注射剂量需要提高到 250 mg/kg,才能获得类似雌鼠的较好造模效果。

本实验在两种动物上的结果显示,雄性动物对四氧嘧啶敏感性较雌性动物低,雄性动物要达到与雌性动物相近的造模效果 (成模率、相近的血糖值浓度和存活率等),四氧嘧啶的使用剂量通常较雌性动物高 20%左右。与王晓琳等[7]的结果完全相反,作者发现雄性 W istar大鼠对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的敏感性明显高于雌性鼠。虽然 STZ和四氧嘧啶二者都是破坏胰岛β细胞,但二者的结构不同,因而出现差异的原因推测可能与药物的作用途径有关。

此外,日本学者门胁孝等[8]报道,雌性 NOD小鼠糖尿病的发病率明显高于雄性,但如果将雌性NOD小鼠的卵巢摘除,其发病率则降低到与雄性相同水平,相反雄性NOD小鼠摘除睾丸后发病率升高到与雌性相似,因此作者认为雌激素可能促进NOD小鼠的糖尿病发病,雄激素则抑制发病。本实验中出现的性别差异是否也与雌激素和雄激素有关,有待进一步研究。

[1] 杨明华,柴可夫,杨苏蓓.四氧嘧啶致糖尿病大鼠模型血糖稳定性考察[J].中国比较医学杂志,2006,18(6):482-484.

[2] 白玉,卢春玲,王会肖,等.建立小鼠糖尿病模型考察降糖胶囊的降糖作用[J].中国比较医学杂志,2007,17(8):61.

[3] 杨明华,杨苏蓓,柴可夫,等.四氧嘧啶致小鼠糖尿病造模条件优化及稳定性考察[J].中药药理与临床,2007,23(5):213-216.

[4] 王柳萍,杨斌,周丽.四氧嘧啶制备小鼠糖尿病模型的影响因素探讨[J].广西医科大学学报,2004,21(1):33-35.

[5] 黄敏,王书奎,王小峰,等.不同禁食时间对四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的血清胰岛素和血糖的影响[J].中国医科大学学报, 2001,32(3):217-220.

[6] 嵇扬,张癸荣,王文俊.建立四氧嘧啶糖尿病模型的研究[J].中医药学刊,2003,21(5):1125-1126.

[7] 王晓琳,邱宗荫,夏永鹏.性别差异对实验性链脲佐菌素糖尿病大鼠造模的影响[J].第三军医大学学报,2009,31(17): 1668-1671.

[8] 庄祥云,译.糖尿病的性别差异[J].日本医学介绍,2001,22 (9):411-412.

D ifferent Effects of Alloxan on Diabetic ModelDuplication in Male and Female An imals

YE Hua-hu,YUAN Ju-fang,LIMin,WANG Yan-jing,DONG Gang,YANGLi-ping, ZHANG Guang-zhou,ZHANG Xiao-fei,ZENGLin
(LaboratoryAnimal Center,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071,China)

ObjectiveTo develop a proper animalmodels representing human diabetes,the efficiency and dosesof alloxan in male and female animalswas investigated。MethodsAlloxan were administered to beagle dogs and mice with different dosage.Blood glucose was tested after trea tment at the 3rd,7th,14th,and 21th day,respectively。ResultsThe different effects of alloxan on the blood glucose concentration was showed in female and male animals.After identical doses of alloxan injected,the blood glucose concentration in female animals increased quickly and its peak was higher than that in male animals.About 70% female dogs were successfully induced to become diabetic models with 40 mg/kg alloxan, corresponding only 40% formale dogs(P<0.01).The most optimum dose of alloxan formale dogswas 50 mg/kg,but 3 female dogs(30%)injectedwith this doseswere dead because of higher blood glucose concentration.Similarphenomenons were found in mice and themostoptimum dose of alloxanwas 200 mg/kg and 250 mg/kg for female and male respectively。ConclusionSensitivity of alloxan to female is higher than that to male.For male animals,the dose of alloxan used to duplicate diabetic animalmodelswould be higher about 20%than that for female animals.

Alloxan;Diabetic;Model,animal;Blood glucose

R587.1

A

1671-7856(2010)01-0019-04

2009-10-19

叶华虎(1970-),男,博士,主要从事新药评价研究。E-mail:huahuy@gmail.com