黏质沙雷氏菌产几丁质酶的发酵工艺优化

施腾鑫,刘嘉,贺淹才

(华侨大学化工学院,福建泉州362021)

黏质沙雷氏菌产几丁质酶的发酵工艺优化

施腾鑫,刘嘉,贺淹才

(华侨大学化工学院,福建泉州362021)

利用均匀设计法,优化一株黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)产几丁质酶培养基的组分;同时,利用正交设计法优化其摇瓶发酵产酶的条件.研究结果表明,最佳培养基组分(质量分数):0.504%胶体几丁质, 1.178%酵母粉,0.025%M gSO4·7H2O,0.095%K2HPO4,0.001%FeSO4·7H2O,0.005%山梨醇,0.030% KH2PO4;最佳摇瓶发酵工艺条件:培养时间为48 h,发酵温度为30℃,初始p H值为9.0,装液量为30 mL,接种量为1%.在此优化条件下,酶活力可达9.39μkat·L-1,比未优化的产酶条件下酶活力提高了81.6%.

黏质沙雷氏菌;几丁质酶;均匀设计;正交设计

几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖用途广泛,除具有抗肿瘤等药用价值外,其应用还涉及到工业、农业和环保等领域[1-2].化学方法生产几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖,面临反应产物难以控制,易造成环境污染等困难.因此,利用几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)降解、生产几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖,越来越引起人们的重视.几丁质酶在实际中应用程度还比较低,主要原因之一是所选菌株产酶能力太低.目前,仅仅对一些产几丁质酶的基因进行了克隆和序列分析,因此,优化微生物产几丁质酶的外部条件,仍是提高微生物菌株产酶水平的主要方法之一[3-4].采用常规优化法(即单因素法)优化几丁质酶发酵条件的研究已有大量报道,而利用统计学方法优化几丁质酶生产的报道却比较少见[5-6].本文通过常规优化法对黏质沙雷氏菌的产酶条件进行预试验,结合均匀设计法和正交设计法,对该菌的产几丁质酶培养基组分及发酵工艺条件进行优化.

1 材料与方法

1.1 菌株

黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens,A TCC14041),购于中科院微生物研究所,在Eppendo rff管中添加质量分数为20%的甘油,并于-70℃下保存.

1.2 试剂与仪器

(1)试剂.几丁质粉(美国Sigma公司);蛋白胨、酵母粉(英国Oxoid公司);其他试剂为国产分析纯.(2)仪器.M icromax(RF)小型台式(冷冻)离心机(北京博奥恒信生物科技有限公司);HYG-Ⅱ恒温调速摇瓶柜(上海欣蕊自动化设备有限公司);SP-2000型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司).

1.3 培养基

基础培养基(1 L):含0.5 g胶体几丁质,1.0 g蛋白胨,0.5 g M gSO4·7H2O,0.07 g K2HPO4, 0.03 g KH2PO4,0.001 g FeSO4·7H2O,p H=7.0～7.2.胶体几丁质的制法参考文[7].

1.4 粗酶液制备

从-70℃冰箱中接取保存于Eppendorf管中的菌种,接种于种子培养基中,于30℃,180 r·min-1的条件下培养12 h.然后,按1%的接种量接种于盛有50 m L基础培养基的250 mL的三角烧瓶中,于30℃,180 r·min-1的条件下恒温振荡培养.最后,于离心机(10 000 r·min-1)中离心发酵液15 min,上清液即为粗酶液.

1.5 几丁质酶酶活力测定

采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[8]测定几丁质酶的酶活力.取发酵液于4℃下离心(10 000 r· min-1)10 min,将0.5 mL上清液和1 mL的M cllvaine’s缓冲液与0.5 mL胶体几丁质混合;于50℃中水浴反应1 h,煮沸10 min,离心(10 000 r·min-1)5 m in.取0.5 m L上清液加入0.5 m L的DNS,煮沸5 min,迅速冷却,加入4 m L蒸馏水,于波长540 nm处测光密度值(D),结果为3次平行实验的平均值.酶活力单位定义:在上述条件下,每分钟产生1μmoL还原糖所需酶量为1个酶活力单位.

图1 黏质沙雷氏菌产酶曲线图Fig.1 Curve of chitimase p roduction output by S.marcesens

2 结果与讨论

2.1 产酶曲线

将活化的液体种子接种于产酶培养基,间隔12 h取样测定酶活力,其产酶曲线图如图1所示.

2.2 发酵工艺条件对黏质沙雷氏菌产酶的影响

2.2.1 培养时间 从图1可知,黏质沙雷氏菌培养12 h后开始产几丁质酶,至第48 h酶活力达到最高,以后逐步下降.

2.2.2 碳源 去除产酶培养基中的蛋白胨,分别以质量分数为0.5%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、几丁质粉和胶体几丁质作为碳源,其他成分不变.培养48 h后,测定几丁质酶的酶活力(z),比较碳源对黏质沙雷氏菌产酶影响,结果如表1所示.从表1可知,在非几丁质底物作用下,菌株不产生几丁质酶.这表明,该几丁质酶为诱导酶,且胶体几丁质是该酶的高效诱导物.

2.2.3 氮源 在基础培养基中,分别以质量分数为1%的蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素,(NH4)2SO4, NH4NO3,KNO3,N H4C1作为氮源,其他成分不变.培养48 h后,测定几丁质酶活力(z),考察有机氮源和无机氮源对黏质沙雷氏菌产酶影响,结果如表1所示.从表1可知,有机氮对产酶有一定促进作用且以酵母粉为最佳,其他无机氮则对产酶具有一定的不利影响.

表1 碳源与氮源对黏质沙雷氏菌产酶的影响Tab.1 Effect of carbon and nitrogen sourceson chitinase p roduction by S.m arcescens

图2 表面活性剂对黏质沙雷氏菌产酶的影响Fig.2 Effect of surfactantson chitinase p roduction by S.marcescens

2.2.4 表面活性剂 在基础培养基中分别加入质量分数为0.02%的SDS,液体石蜡,Triton X-100,吐温-80,山梨醇,PEG-8000,其他成分不变.培养48 h后,测定几丁质酶活力,考察不同表面活性剂对黏质沙雷氏菌产酶的影响,结果如图2所示.

从图2可知,山梨醇对菌株的产酶水平有较为明显的提高;PEG-8000对提高产酶的效果不明显;而SDS、液体石蜡、Triton X-100及吐温-80对该菌产几丁质酶有一定抑制作用.这可能是,由于非离子表面活性剂与酶分子之间仅存在氢键和疏水作用,因而其抑制性较弱,但不同的表面活性剂间的抑制性仍有差别.

2.2.5 发酵温度 将黏质沙雷氏菌于不同温度环境下培养产酶,结果如图3所示.从图3可以看出,黏质沙雷氏菌在28～30℃时,产酶能力较为稳定.其中,在30℃时的产酶水平最高,而高于30℃,酶活力迅速降低.

2.2.6 初始p H值 将黏质沙雷氏菌于不同p H值环境下培养产酶,结果如图4所示.从图4可知,当培养基起始p H值为9.0时,酶活力最高;当p H值在8.5～11.0范围内,该黏质沙雷氏菌产酶稳定;而当p H值低于8.5时,酶活力迅速下降.该菌耐碱性较好,但对酸性环境敏感.

图4 起始p H值对黏质沙雷氏菌产酶的影响Fig.4 Effect of initial p H on chitinase p roduction by S.m arcescens

图3 发酵温度对黏质沙雷氏菌产酶的影响Fig.3 Effect of incubation temperature on chitinase p roduction by S.m arcescens

2.3 产酶培养基组分的优化

以培养基中胶体几丁质、酵母粉、山梨醇,M gSO4,K2HPO4,KH2PO4为因素,进行均匀设计.在30℃,初始p H值为9.0,180 r·min-1下振荡培养48 h后测定酶活力,结果如表2所示.表2中:X1～X6分别为胶体几丁质,酵母粉,M gSO4,K2HPO4,KH2PO4,山梨醇的质量分数;Y为酶活力.用DPS V 7.05统计软件进行回归分析,可得回归方程为

其中,相关系数R为0.974,经F值检验合格;显著水平P为0.019(小于0.05),已达显著水平.

根据回归方程,当X1(胶体几丁质)为0.504%,X2(酵母粉)为1.178%,X3(M gSO4)为0.025%, X4(K2HPO4)为0.095%,X5(KH2PO4)0.030%,X6(山梨醇)0.005%时,Y值(酶活力)达到最大值9.30μkat·L-1.3次重复试验,酶活力达(9.30±0.67)μkat·L-1,接近预测值.

表2 培养基配方均匀设计表Tab.2 Uniform design table of the culturemedium components

2.4 发酵工艺条件的优化

以培养时间(A)、初始p H值(B)、发酵温度(C)、装液量(D)为考察因素,采用L9(34)表进行正交实验,如表3所示.根据单因素考察接种量的影响,说明接种量对黏质沙雷氏菌诱导产酶没有明显影响.这可能是在营养丰富的环境中,黏质沙雷氏菌迅速增殖,由接种量不同所带来的影响被很快持平.

由表3的极差值R可看出,4个因素中发酵时间影响最为显著.各因素对试验结果影响排名依次为A>B>D>C,其最优水平组合为:A2-B 3-C2-D 1.即培养时间为48 h、起始p H值为9.5,发酵温度为30℃,250 m L三角瓶装量为30 m L.

根据试验结果分析选出的最优培养基和培养条件,进行3次摇瓶产酶验证,均值为(9.39±0.83)μkat·L-1.这说明,优化后的参数是可靠的,比优化前酶活力(5.15 μkat·L-1)提高了81.6%.

3 结束语

采用均匀设计结合正交设计进行发酵条件优化,所得到酶活力最大值为9.39μkat· L-1,说明优化方法是行之有效的.该黏质沙雷氏菌产酶环境的最适p H值为9.5,耐碱能力较强,因此,利用该菌在盐碱地上进行几丁质废料的降解有着诱人的前景.

表3 发酵工艺条件正交实验结果Tab.3 O rthogonal-design result of the op timal culture conditions

[1] SUZU KI K,M IKAM I T,OKAWA Y,et al.Antitumo r effect of hexa-N-acetylchitohexose and chitohexose[J].Carbohydr Res,1986,151:403-408.

[2] 韩宝芹,余长缨,刘万顺,等.几丁质酶研究现状及展望[J].中国海洋药物,2001,83(5):41-43.

[3] 孙胜利,喻子牛,贾新成.微生物产几丁质酶的研究和应用进展[J].微生物学杂志,2002,22(5):47-50.

[4] 张荣奎,贺淹才,刘爱花,等.土壤产几丁质酶菌株的筛选鉴定及产酶条件[J].华侨大学学报:自然科学版,2007,28 (2):178-181.

[5] 陶勇,龙章富,金虹,等.均匀设计法对产几丁质酶细菌C4发酵条件的优化[J].生物技术,2004,14(6):44-46.

[6] 田强,张彩,吴子健.几丁质酶生产菌的诱变育种及摇瓶发酵条件优化[J].食品科学,2007,28(9):405-409.

[7] JEUN IAUX C.Methods in enzymology[M].New York:Academic Press,1966:644-650.

[8] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验技术[M].北京:高教出版社,1997:111-116.

Culture Parameter Optim ization of Chitinase Production by Ser ratiama rcescens

SH I Teng-xin,L IU Jia,HE Yan-cai
(College of Chemical Engineering,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

Chitinase-p roducing Serratiam arcescens culturemedium components and culture conditionsof enzyme p roduction by shake flask fermentation were op timized with uniform-design and o rthogonal-design respectively.The results showed that the op timal component concentrations(m/m)were colloid chitin 0.504%,yeast extract 1.178%,M gSO4· 7H2O 0.025%,K2HPO40.095%,FeSO4·7H2O 0.001%,so rbitol 0.005%,KH2PO40.030%.The op timal culture conditionswere incubation time 48 h,temperature 30℃,initial p H 9.0,loadage 30 mL per 250 m L flask,inoculation quantity 1%.The activity of chitinase reached 9.39μkat·L-1w hich was increased by 81.6%than that of the unop timized conditions..

Serratiam arcescens;chitinase;unifo rm-design;o rthogonal-design

TQ 920.6;TQ 929+.2

A

(责任编辑:黄晓楠 英文审校:陈国华)

1000-5013(2010)06-0667-04

2009-01-04

贺淹才(1949-),男,教授,主要从事生物化学与分子生物学的研究.E-mail:yche@hqu.edu.cn.

福建省自然科学基金资助项目(C04010011)