毛细管电泳法定量测定发酵产物中的洛伐他汀

杨先鸣，李 敏，张 汆，王金秀

（滁州学院 化学与生命科学系，安徽 滁州 239000）

毛细管电泳法定量测定发酵产物中的洛伐他汀

杨先鸣，李 敏，张 汆，王金秀

（滁州学院 化学与生命科学系，安徽 滁州 239000）

建立了发酵样品中洛伐他汀的毛细管电泳定量测定方法。以含12%乙醇(V/V)的50mmol/L甘氨酸（Gly）-NaOH为背景缓冲液，检测波长238 nm,操作电压28 KV，压力(5kPa)进样5 s，毛细管：48.5/40 cm×50 μm。在优化的条件下，线性范围4.0-80.0μg/mL（相关系数r=0.9997，n=8），加标回收率88.13%-101.29%，最低检出限为1.0μg/mL,定量检出限为3.3μg/mL，相对标准偏差1.32%-1.64%。该方法简便有效。可用于发酵品中洛伐他汀的定量检测。

毛细管电泳；洛伐他汀；发酵品；定量分析

洛伐他汀（Lovastatin,LVT）是从红曲酶中发现的一种强效降血胆固醇的活性物质[1]。目前，洛伐他汀主要是从红曲发酵品中获得，检测发酵品中LVT方法的研究对于控制发酵工艺条件非常重要。在实际生产中,由于发酵产物中的组份较复杂,洛伐他汀含量低,且在发酵的过程中含量有一定变化,所以要求建立一种分析速度快、灵敏度高的分析方法。目前报道的测定LVT的方法主要有高效液相色谱[2,3]和紫外分光光度法[4]。但少见利用毛细管电泳来检测发酵品中的洛伐他汀。与液相色谱分析法相比，高效毛细管电泳（CE）具有高效、快速、低耗、超微量进样、污染少、适合大批量自动分析等优点，已在分析科学领越得到较广泛的应用。本文采用常用试剂利用简单方法提取发酵品中的LVT，直接上样分离检测LVT，通过在背景缓冲溶液中添加适量乙醇，在5min内可同时完成LVT的分离和测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent CE G1600A；DAD检测器色谱工作站；熔融石英毛细管 （50μm48.5/40.0cm）（美国 Agilent公司）。Milli-Q超纯水（美国Millipore公司）；PHS-3C数显型酸度计 (上海宇隆仪器有限公司）；KQ2200B型超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）；水相微孔滤膜0.45μm；洛伐他汀（≥99.1%）、发酵品，由浙江海正股份有限公司提供；甘氨酸（上海源聚生物科技有限公司），无水乙醇（无锡市亚盛化工有限公司），氢氧化钠（广东汕东西陇化工厂），试剂均为分析纯。

1.2 样品处理

精确称取样品100mg用1000μL含50%（V/V）乙醇的Gly-NaOH缓冲溶液 （50mmol/L,pH=10.5）提取发酵样品：超声波振荡 (40℃,20 min)。5000 rpm/min离心5 min，然后取上清100μL,加400μL上述Gly-NaOH缓冲溶液摇匀后上机检测。

1.3 标准溶液的配制

准确称取洛伐他汀标准品10.0mg，用含50%（V/V）乙醇的Gly-NaOH缓冲溶液（pH=10.5）溶解并定容至10.00mL，制得浓度为1.0mg/mL的储备液。分别移取储备液20，40，80，160，240，320，400 μL，加到100mg样品空白中，加入含乙醇的Gly-NaOH缓冲溶液（pH=10.5）至1000μL（最终溶液含50%乙醇），按1.2操作，取100μL上述标准溶液加400μl背景缓冲溶液，混匀后上机检测。

1.4 缓冲溶液的配制

称取甘氨酸（Gly）配制成100mmol/L，稀释至浓度为30-90mmol.L-1的缓冲溶液。用NaOH溶液调至pH为9.0-11.0，最终确定的背景缓冲溶液为12%乙醇的50mmol/L Gly-NaOH（pH=10.5），用微孔滤膜过滤后使用。

1.5 电泳条件

毛细管温度控制在20°C.运行电压28kV,50kPa压力进样5s。阴极端DAD检测，检测波长238nm。进样前，毛细管依次用超纯水、NaOH、超纯水和背景缓冲液压力冲洗 10min、20 min、5 min和 10 min.两次进样中间用缓冲液冲洗2min。

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件的选择

Lovastatin是一种白色针状晶体，易溶于甲醇、乙醇等有机试剂和碱性溶液，在水溶液中，Lovastatin具有酸式与内酯型两种形式，见图1，在pH＞7.7时，内酯环开环呈酸式结构；在pH3.0时呈内酯形式[3]，当用无水乙醇提取，取上清加缓冲液后，测试电泳图杂峰较少，但目标峰和乙醇峰重合，只有很小的负离子峰，说明LVT主要以不带电的内酯型存在，随着放置时间的增加，峰高逐渐增高，需要一定时间才能稳定。因此考虑样品的性质和电泳分析方法的要求，采用V（乙醇）：V（缓冲溶液pH=10.5）=1：1的混合溶液提取LVT，使LVT全部转化为酸式结构。实验表明，放置3天，峰高没有明显变化，这种提取方法简单易行。

图1 lovastatin的酸式和内酯式结构式

2.2 电泳条件优化

2.2.1缓冲溶液对分离的影响 试验了磷酸、硼砂、甘氨酸与NaOH配制成的缓冲溶液作为背景电解质，实验表明，在相同浓度和相同pH条件下，三种缓冲溶液对分离的效果没有显著差别，且Gly-NaOH的电流最小，因此选择Gly-NaOH进行浓度和pH做条件优化实验。由于LVT酸的pKa在9左右[5]，考虑到LVT的离解度，选取pH9.0-11.00范围进行优化。 实验表明， 当固定缓冲液浓度80mmol/L，随着pH的增大，峰高略增加，pH〉10.50时，峰高不变，但不能得到基线分离。故在pH=10.50的条件下，考察浓度30-90mmol/L的目标峰分离情况，发现随着浓度的增大，迁移时间变长，峰高无明显变化，但仍不能得到基线分离。故采用在50mmol/L，pH=10.50的Gly-NaOH背景缓冲溶液中加入有机添加剂进行分离条件优化实验。

2.2.2有机添加剂乙醇浓度的影响 选择毒性较小的乙醇作为缓冲溶液添加剂。乙醇浓度（V/V）选择6—18%，考察其对分离度和出峰时间的影响。随着乙醇浓度的提高，目标峰与杂质分离的分离效果越好，达到12%时，可以基线分离。但乙醇浓度的增加使峰高有所下降且峰宽增大，迁移时间变长（见图2）。考虑分离效果和实验时间，选择乙醇浓度为12%，在5min内达到基线分离（见图3）。

图2缓冲溶液中乙醇浓度的影响

图3加入乙醇对分离效果的影响

2.2.3电压的影响 在上述优化条件下，改变电压20-30kV，考察分离情况。实验表明，在所试电压条件下，均可得到基线分离；比较逢高和出峰时间，随着电压的增大，逢高略有增加，出峰时间缩短，考虑时间因素，选择了稍低于仪器极限电压的次高值28kV为操作电压。

2.3 方法的准确性和精密度

2.3.1专一性 为了检验方法的专一性，在优化条件下，分别作了样品空白、实际样品的电泳图，并在样品中加入标准溶液，对照三条电泳曲线，确定LVT在4-5min出峰，由图4可知目标峰能很好的分离。

图4 空白、样品及加标电泳图

2.3.2工作曲线 按1.3方法，制得一系列标准溶液，浓度分别为 4、8、16、32、48、64、80μg/mL，在优化电泳条件下，测LVT峰高，以浓度为横坐标，峰高为纵坐标，绘制工作曲线。线性方程为y=0.203+ 0.130x，R=0.9997。方法的线性范围为4-80μg/mL，按信噪比3：1，计算最低检测限 （LOD）为1.0μg/ mL；10倍信噪比的定量检测限为3.3μg/mL.

2.3.3方法精密度 选取适量标准储备溶液按1.3处理，得到浓度为4、32、80 μg/mL的溶液，在优化条件下分别测定6次，计算标准差和相对标准差。结果表明，相对标准差在1.32-1.64%，说明新方法的精密度较好。

2.3.4方法的准确性 为了验证方法的可靠性,采用在已知含量样品中加入浓度为8，16，24μg/mL的标准品,在优化条件下检测LVT含量（n=3）。 计算回收率。结果表明回收率在88.13-101.29%，在可接受范围。说明新方法是可靠的。如表1所示。在优化条件下，检测了4种不同LVT含量的发酵品，结果如表2。

表1 LVT的加标回收率实验结果（n=3）

表2 4种发酵品中LVT的测定结果（n=3）

3 结论

以一定体积比的乙醇和缓冲溶液的混合液作为电泳背景电解质，建立了一种毛细管区带电泳定量测定发酵品中的LVT的方法。结果表明，此方法简单，有效。采用常见简单试剂，消耗少，避免使用有毒的有机试剂，符合环境保护的理念。方法的检出限、回收率、精密度，相关系数均达到要求，适用于生产过程中LVT的检测。

［1］EndoA,MonacolinK.newhypocholesterolemic agent produced by a Monascus species[J].J.Antibiotics,1979，32（8）:852-854.

［2］Fruedrich J,Zuzek M.,Bencina M,et.al.High-Performance liquid chromatographic analysis of mecinolin as mevinolinic acid in fermentation broths[J].J.Chromatogr A.1995，704：363-367.

［3］贾波,孙佰申,周立平.HPLC法测定红曲霉发酵样品中Monacolin K的含量[J].食品与发酵工业，2003,29(11)：70-72.

［4］文镜，顾晓玲，常平,等.双波长紫外分光光度法测定红曲中洛伐他汀的含量[J].中国食品添加剂，2000(4):11-17.

［5］Srinivasu M K,Narasa Raju A,Om Reddy G,Determination of lovastatin and simvastatin in pharmaceutical dosage forms by MEKC [J].J.Pharm.Biomed.Anal.，2002,29(4)：715-721.

[责任编辑：钱立武]

O633

A

1674-1102（2010）03-0022-03

2010-03-23

安徽省应用化学省级重点学科建设项目（200802187C）;滁州学院科研项目（2008kj018B）。

杨先鸣(1957-)，男，山东牟平人，滁州学院化学与生命科学系实验师，研究方向为生物分离与分析。