植物蛋白原料抗营养因子及其消除方法的研究进展

浙江万里学院生物与环境学院 高有领 汪财生 朱秋华 钱国英＊

在水产养殖中，饲料是很重要的一个组成部分，鱼粉是传统的饲料蛋白源，它也是饲料中价格最高和最重要的组成成分。但是随着水产养殖业的快速发展，在不远的将来鱼粉将会出现短缺现象，FAO估计世界鱼粉供应量只会维持到2015年（FAO，2002）。此外，鱼粉是价格较高的蛋白源，经济上的压力将会使得人们考虑降低对鱼粉的依赖性，并去寻找一些价格较低，更合适的鱼粉替代物（Tacon，2004）。此外，由于现有鱼粉资源竞争的加剧以及人们在食品安全、环境保护方面意识的提高，均会促使水产养殖业寻找合适的鱼粉替代物。以大豆为代表的植物蛋白具有很好的应用潜力（Maitra 等，2007；Refstie 等，2006a）。 但是植物蛋白原料也存在缺点，如含有各种各样的抗营养因子（ANFs）。正因为抗营养因子的存在，植物蛋白原料的加工处理对于其可利用性，显得尤为关键。本文将对目前植物蛋白抗营养因子及植物蛋白原料主要处理方法的研究进展进行综述，以期能为后续的植物蛋白原料处理研究提供参考。

1 植物蛋白源

水产饲料中使用主要植物蛋白源有：豆粕、油菜籽、羽扇豆籽、豌豆、葵籽饼、棉籽、苜蓿叶、芥子油饼、芝麻等。而豆粕被认为是目前最适宜的鱼粉替代物（Dersjant-Li，2002），其产量在所有的植物蛋白中是最多的。豆粕因为具有较高的蛋白质含量，相对平衡的氨基酸配比，因此也被认为是一种高质量的植物蛋白源（Storebakken等，2000）。除豆粕外，油菜籽饼和棉籽饼在水产饲料中也是应用较多的植物蛋白源。但是植物蛋白源也存在缺点，除了氨基酸的组成较不合理之外，一般都含有各种各样的抗营养因子。由于抗营养因子的存在，在水产饲料中，植物蛋白只能部分替代鱼粉，而不能全部替代，而且，有时候部分替代也会对鱼的生长性能产生负面影响（Refstie等，1998）。

2 抗营养因子

植物蛋白源中的抗营养因子多种多样，它们大至可分为4种：影响蛋白质利用和消化的因子，如蛋白酶抑制因子；影响微量元素利用和消化的因子，如植酸；影响维生素利用的因子，如抗维生素因子；其他如毒枝菌素、植物雌激素、生物碱和异黄酮等（Francis等，2001）。常用植物蛋白原料中的主要抗营养因子见表1。本文主要介绍胰蛋白酶抑制剂、植酸、植物凝集素、非淀粉多糖硫化葡萄糖苷等主要的抗营养因子。

表1 常用植物蛋白原料中的主要抗营养因子

2.1 胰蛋白酶抑制剂 胰蛋白酶抑制剂在许多植物蛋白源中都存在，它主要抑制鱼类胰岛素和胰凝乳蛋白酶的活性 （Storebakken等，2000），从而影响蛋白质消化率、饲料转化率和鱼体肉质。根据胰蛋白酶抑制剂作用对象的不同，可分为4种类型，即：丝氨酸抑制剂、半胱氨酸抑制剂、金属抑制剂和天冬氨酸抑制剂（Chong等，2002），其中丝氨酸抑制剂和半胱氨酸抑制剂在植物的种子和贮藏组织中大量存在。

胰蛋白酶抑制剂已被证实对许多鱼类的生长会产生不良影响。Krogdahl等（1994）在虹鳟鱼饲料中添加0.37%～1.48%的大豆胰蛋白酶抑制剂时，会使得蛋白质的消化率从93%降至70%。对于鲑鱼，除了之前已经确认饲料添加大豆胰蛋白酶抑制剂会降低鱼体增重、蛋白质和脂肪的消化率以及肠道的胰岛素之外（Olli等，1994），后来的研究发现饲料中添加从土豆中分离出来的蛋白酶抑制剂，除了蛋白质的消化率有降低作用以外，对于脂肪的消化率无显著影响，而且能使鱼体的特殊生长率（SGR）升高14%和31%（Sveier等，2001），其原因是由于土豆蛋白酶抑制剂改变了胃蛋白酶的活性以及影响了肠道不同部位的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和羧肽酶B引起的。

由于各种鱼类对胰蛋白酶抑制剂的耐受能力不一样，因此所产生的影响也有显著差异。鲤鱼对于胰蛋白酶抑制剂有较强的耐受能力，用胰蛋白酶抑制剂含量达24.8 mg/g和含量为1.3～8.3 mg/g的多种饲料饲喂时，鱼体生长性能无显著差异（Makkar和 Becker，1999）。 Rumsey（1991）报道，饲料中低于5 mg/g胰蛋白酶抑制剂不会对虹鳟鱼的生长产生很大的影响。

除了研究胰蛋白酶抑制剂对鱼的生长性能的影响以外，一些学者分别用体外法和体内法研究了其对鱼的消化蛋白酶活性的影响。Alarcon等（1999）用体外法测定了植物蛋白提取物对金头鲷（Sparus aurata）消化蛋白酶的作用，结果表明，不同的植物蛋白提取物对消化蛋白酶活性的抑制率为25%～50%。El-Sayed等（2000）用体内法研究了经不同处理的豆粕和小麦麸对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）消化蛋白酶活性的影响，结果观察到对消化蛋白酶的抑制率为67.4%～87.2%。另有通过豆类提取物对消化蛋白酶活性的研究，发现豆类提取物不会影响胃蛋白酶活性，但对肠的蛋白酶却有显著影响 （Alarcon等，2001）。 Maitra 等（2007）用体外法测定了大豆、草豆、黑绿豆和马豆的种子提取物对南亚野鲮（Labeo rohita）消化蛋白酶活性的影响，并比较了这些植物对蛋白酶活性所产生的抑制效果，结果表明它们的抑制率分别超过了30%、50%、50%和40%。

2.2 植酸 植酸普遍存在于植物种子中，它是植物蛋白质原料中主要的抗营养因子之一。常见的植物蛋白质原料如豆粕、菜籽饼和芝麻饼中都含有一定量的植酸，例如：豆粕为10～15 g/kg，菜籽饼为50～74 g/kg，芝麻饼为24 g/kg。植酸能与磷结合形成植酸磷，鱼类的消化系统中由于缺乏植酸酶，因此不能利用植酸磷。植酸还能与一些金属离子形成稳定的不溶性络合物，从而降低了这些矿物质元素的利用率，甚至引起矿物质元素缺乏症。此外，植酸还能与蛋白质形成难溶的植酸蛋白质络化物，影响鱼体对蛋白质的吸收利用（Storebakken 等，2000）。

Sajjadi和 Garter（2004a）在鲑鱼的饲料中的添加10 g/kg的植酸钠之后，发现额外添加植酸钠并不会对饲料采食量和鱼体增重产生显著影响，也不会减弱胰蛋白酶的活性，但是却会显著降低蛋白质消化率。Riche和Garling（2004）对罗非鱼也做了类似的研究，研究包括两个试验，在第一个试验中，在所采用的部分豆粕饲料中添加了植酸酶，目的是利用植酸酶来酶解豆粕饲料的植酸，从而探究饲料中植酸含量降低对鱼体氮的贮留率的影响。另一试验直接往饲料中添加不同量的植酸，以确定其对氮的贮留率的影响。最终所得到的研究结果与前述研究正好相反，即植酸不会降低氮的贮留率，而且豆粕中的植酸酶会降低氮的贮留率。Denstadli等（2006a）探讨了不同剂量植酸对鲑鱼生长和矿物质元素的利用的影响，认为鲑鱼对植酸的耐受水平为4.7～10.0 g/kg，且矿物质元素的利用率随着植酸含量的增多而降低。

Helland等（2006）就不同水平植酸对大西洋鲑鱼的骨骼发育和矿物质元素在体内积存的影响进行了研究，结果表明，植酸对于鱼体和脊柱磷的积累无显著影响，但是，高水平的植酸却对Ca、Mg、Ca∶P和脊柱中Zn的积累产生了负面影响，同时，出现一种比较新奇的脊柱病理现象，即超密度脊柱，随着饲料中植酸水平的升高，超密度脊柱现象从最初的16%升至45%～60%。

2.3 植物凝集素 植物凝集素主要存在于植物的籽实中，是一种具有凝集红细胞能力的植物蛋白质。它能与细胞膜上碳水化合物中的糖结合，从而发生凝集反应。虽然植物凝集素是一种蛋白质，但是对于肠道中的蛋白质水解却有抑制作用。它们的生物学作用体现在破坏小肠的新陈代谢和对小肠绒毛形态上的破坏。有报道称，如果饲料中含有较高浓度（60%）的大豆蛋白，或者往饲料中加入了一定量植物凝集素，再用这些饲料饲喂鲑鱼和虹鳟鱼，那么经免疫组织化学分析后，就会发现有植物凝集素结合在小肠绒毛的上皮细胞上，这预示着当鱼饲料中含有一定量的大豆蛋白时，植物凝集素与肠道上皮的结合是肠道产生病理变化的原因（Buttle 等，2001）。

2.4 非淀粉多糖 非淀粉多糖（NSPs）能与胆汁酸结合，且由于本身分子之间相互作用形成网状结构，限制了肠道中的消化酶和其他物质的的作用（Storebakken 等，1998），因此非淀粉多糖与寡糖一起起作用，降低了脂肪的消化率，同时增加了鱼粪的含水量，从而限制了鱼对水的利用（Refstie等，1999；Storebakken 等，1998）。

3 抗营养因子消除方法

3.1 物理法 物理方法包括加热处理方法（挤压膨化、蒸汽、微波和炒烤等）、机械加工方法以及水处理法。物理方法能较大程度地钝化热不稳定抗营养因子，如蛋白酶抑制因子。通过加工工艺的改进，一般能使得热不稳定抗营养因子降到水产动物能够耐受的水平。目前研究最多的方法是挤压膨化。Cheng和Hardy（2003）用挤压膨化技术对豆粕、大麦、玉米麸质和小麦进行了处理，并制成膨化饲料饲喂虹鳟鱼，试验结果表明，挤压膨化处理过程可以显著提高干物质、粗蛋白质、粗脂肪的消化率，改善矿物质元素和能量的利用率。Allan和Booth（2004）运用挤压膨化技术对豌豆、豆粕、羽扇豆和菜籽饼进行了处理，制成饲料后对银鲈（Bidyanus bidyanus）进行饲喂并观测各种饲料原料的消化率，结果发现挤压膨化对上述几种植物饲料原料消化率影响效果不一：改善效果最好的是豌豆，其次是豆粕，对羽扇豆无显著影响，而对菜籽饼的消化率却有负面效果。Venou等（2006）研究了经挤压膨化处理的豆粕对两种不同大小金头鲷（Sparus aurata）蛋白质转化效率和饲料转化效率的影响，结果发现经处理后的豆粕能显著改善大鱼的蛋白质转化效率和饲料转化效率，但对于小鱼，只是改善了蛋白质转化效率，对饲料转化效率无显著影响。同时，他们也观测到豆粕经膨化处理能明显提高胰蛋白酶的活性。

一般认为，在挤压膨化处理过程中如果温度过高，会对营养物质造成一定量的损失。因此，寻求适当的挤压膨化处理方式，也是目前的一个研究热点。Romarheim等（2005）用湿式挤压膨化法对两种不同的豆粕原料进行处理，以制成饲料饲喂大西洋鲑鱼。一种豆粕是脱脂豆粕，另一种是经温热处理的豆粕。结果说明挤压膨化不会明显改变饲料的氨基酸组成，也不会影响豆粕中的氨基酸消化率，但是两种豆粕中的胰蛋白酶抑制剂降低76%。据此，作者认为挤压膨化处理能够有效地去除胰蛋白酶抑制剂，同时这种处理方法对营养物质造成的损失也是很小的，是比较温和的处理方法。

以挤压膨化处理为代表的热处理方法能有效地将热不稳定抗营养因子降低到鱼能够耐受的水平，但是对于热稳定抗营养因子的处理效果有限，而且相对来说处理成本较高。

3.2 生物学方法 生物学的处理方法是较为传统的方法，近年来由于其具有处理效率高、成本低、没有残留问题，应用比较安全，对饲料营养成分的影响和破坏也较小等独特优点，正越来越引起人们的重视。生物学方法包括微生物发酵、酶制剂处理、植物育种和发芽处理等方法，本文将只讨论微生物发酵和酶制剂处理法。

3.2.1 微生物发酵 微生物发酵法主要是利用微生物发酵产生的各种酶类来消除原料中的抗营养因子，如在发酵过程中可产生水解酶、发酵酶和呼吸酶等，因此可以有效地去除蛋白酶抑制因子，也能去除植物蛋白原料中对水产动物生长和健康的产生负面影响的一些碳水化合物，如非淀粉多糖和不可消化寡糖。由于在发酵过程中，微生物还能将植酸转化为细胞中的有机盐，因此也能有效地去除植酸。除了能钝化多种抗营养因子之外，发酵还能对营养组分进行体外降解，提高了各营养成分的消化吸收率，也可明显提高饲料原料的适口性。此外，在发酵过程中，微生物大量繁殖，把部分大豆原料转化为菌体蛋白，改善了蛋白质的品质。如Hong等（2004）用米曲霉GB-107发酵生豆粕并对发酵后的豆粕与经别的方法处理的豆粕在营养价值上进行了对比，结果表明，发酵过程在不改变必需氨基酸组成的情况下能增加10%的粗蛋白质，还能消除豆粕中的大部分胰蛋白酶抑制剂，以及增加小肽的含量。Lampart-Szczapa等（2006）报道，经乳酸发酵处理后的羽扇豆籽具有较多的可溶性蛋白。

关于发酵处理后植物蛋白原料对鱼类的影响有许多报道。Shimeno等（1994）用宇佐美曲霉对溶剂卒取的豆粕进行发酵，但结果由于得到的发酵豆粕物理特性较差，因此在随后进行的鱼类养殖试验中未得出正确的评价结果。Mukhopadhyay和Ray（1999）报道，乳酸菌发酵处理极大地改善了用于饲喂南亚野鲮的芝麻籽饼营养价值。乳酸菌在以后的发酵研究过程中逐渐成为一种常用的菌种。 Skrede等（2003、2002、2001）用乳杆菌成功地降低了小麦饼和大麦饼中的非淀粉碳水化合物的水平，而且发现在膨化饲料中，用发酵法处理过的谷物来替代未经发酵处理的谷物，可以显著提高大西洋鲑鱼对淀粉、油脂和能量的表观消化率（Skrede 等，2002）。Refstie 等（2005）用乳酸菌对豆粕进行处理，并作为蛋白质来源饲喂大西洋鲑鱼，结果证实了乳酸菌发酵能有效去除豆粕中的蛋白酶抑制因子和不可消化碳水化合物，同时部分去除饲料中限制脂质吸收的因子，改善了豆粕的营养价值。微生物发酵不仅能降低非淀粉碳水化合物水平，而且能够显著降低植酸的含量。如上述研究也证实了乳酸菌发酵能降低谷物 （Skrede等，2003）和芝麻籽饼（Skrede 等，2001）中的植酸含量。

另一方面，Forde-Skjarvik等（2006）的研究表明，用经生物学方法处理的豆粕部分替代鱼粉饲喂鳕鱼仍然会降低粗蛋白质、粗脂肪、能量和几乎所有氨基酸的消化率。Refstie等（2006b）也得出了相同的结果，即鳕鱼（Gadus morhua）氨基酸和脂肪的消化率会受到经生物学方法处理的豆粕的抑制，但是他们也观察到鳕鱼生长的体成分无显著变化。原因认为是鳕鱼的消化道具有较好的适应能力，能通过结构的改变来适应豆粕料（Refstie等，2006b）。

3.2.2 酶处理法 酶制剂处理法是应用酶制剂对原料进处理，利用酶来消除饲料原料中的抗营养因子，如当前应用较为广泛的是植酸酶，它能水解植酸从而破坏其抗营养作用。但是酶制剂在饲料原料加工处理过程中易受高温高压的影响，如在用挤压膨化方式加工饲料的过程中，酶就会被破坏，达不到预期的效果。因此，目前的研究主要有以下三个方面，一是在植物蛋白质原料中添加酶制剂，研究对鱼生长的影响；二是从鱼类所需最适添加量方面进行研究；最后一个方面研究如何使用酶制剂才能达到最好的使用效果，即加工处理过程中的使用方法。

使用植物蛋白源时，如果添加一定量的酶制剂，往往能够改善鱼类的生长性能和对矿物质元素的利用。Cheng和Hardy（2002）证实往大麦、菜籽饼、小麦和小麦粗粉中添加了500 FTU/kg的植酸酶能显著提高虹鳟鱼对Ca、Mg、Mn、总磷和植酸磷的消化率，以及总能的利用率。另有Vielma等 （2004）证实植酸酶能改善虹鳟鱼对磷的利用率，提高蛋白质的效率。Saijadi和Carter（2004b）就菜籽饼添加植酸酶后对鲑鱼利用磷的效率进行了研究，得到了较为相似的结果，即植酸酶能够改善磷的利用率，因此，减少了磷的浪费。同一作者也证实了植酸酶通过限制植酸对蛋白质的影响，从而改善鲑鱼的生长性能 （Sajjadi和 Carter，2004a）。 Debnath 等（2005a、2005b）也有类似的研究，他们证实了植酸酶对Pangasius pangasius生长性能和磷利用的正面效果。Ai等（2007）除了对植酸酶的作用进行了研究，还对非淀粉多糖酶的作用进行了探讨，观察到非淀粉多糖酶也能改善石首鱼（Lateolabrax japonicus）的生长和饲料利用率。

饲料原料如果添加过量酶制剂，会扰乱鱼类消化道的正常消化机能而产生不良反应。因此确定合适的酶制剂使用量也是一个重要的研究内容。Yan等（2002）在斑点叉尾 （Ictalurus punctatus）的饲料添加1000 FTU/kg的植酸酶，结果观察到骨骼中Ca、P、Mg和Mn的含量显著提高。Debnath等（2005b）的研究结果表明，在鲶（Pangasius pangasius）饲料中500 FTU/kg植酸酶添加量能够促进鱼的生长和饲料利用率。Biswas等（2007）也观察到2000 FTU/kg的植酸添加量能够减少磷流失，促进鱼体的生长。酶制剂在饲料原料加工处理过程易受高温高压的影响，如挤压膨化加工处理饲料时，酶就会被破坏，达不到预期的效果。因此酶制剂使用时的温度、湿度和持续时间是非常关键的因素。Denstadli等（2006b）探讨了不同温度、湿度和持续时间对酶制剂处理效果的影响，结果表明，在温度为45℃，湿度为45%的条件下，持续处理45 min时是效果最好的，此时小麦和豆粕中的植酸能够降低86%。

4 结语

在水产养殖业中，植物蛋白作为鱼粉的替代物，正越来越引起人们的重视。由于植物蛋白原料中含有抗营养因子，因此，与植物蛋白利用效果密切相关的原料处理技术显得尤其重要。挤压膨化法、微生物发酵法和酶制剂处理法是主要植物蛋白原料的处理方法，也是目前较为热门的三种方法，建议今后的研究在继续完善处理各种工艺的基础上，结合多种处理方法，以取得最好的处理效果。

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