运动调节 CSE/H2S系统在实验性 SD大鼠动脉粥样硬化进程中的作用

刘 芳

(西南大学体育学院,重庆 400715)

运动调节 CSE/H2S系统在实验性 SD大鼠动脉粥样硬化进程中的作用

刘 芳

(西南大学体育学院,重庆 400715)

探讨动脉粥样硬化进程中胱硫醚 -r-裂解酶/硫化氢 (CSE/H2S)系统的变化以及有氧运动对该系统的影响。方法:以实验性动脉粥样硬化 (atherosclerosis,AS)SD大鼠 16只做为动物模型,随机分为M组 (运动组)每天游泳运动 30分钟持续 8周 (n =8),和不做运动组N(n=8)。同时设正常对照组 C(n=8),给予普通饲料喂养。然后取静脉血和主动脉组织,分别用沉淀漂浮酶联法、和去蛋白法测定各实验组血中 TC、TG、LDL、HDL、H2S含量,用亚甲基蓝法主动脉组织中诱导型胱硫醚 -r-裂解酶的活性。结果:8周末与对照组比较,发现模型组M、N血脂水平明显升高,血浆中H2S含量下降,CSE活性减少,与C组相比差异有显著性。

动脉粥样硬化;胱硫醚 -r-裂解酶;硫化氢;有氧运动

数百年来硫化氢 H2S一直被认为是空气和水源污染的重要污染物 ,内源性 H2S为机体含硫氨基酸代谢终末废物。近年研究发现 H2S[1]是继 NO和 CO之后发现的一种独特的血管活性物质,在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)进程中具有重要作用。内源性的 H2S是以体内含硫的氨基酸如半胱氨酸、蛋氨酸和同型半胱氨酸(Hcy)等为底物,被 5’-磷酸吡多醛依赖性酶包括胱硫醚 -β -合成 (cystathionine-β -synthase,CBS)、胱硫醚 -γ -裂解酶 (cystathionine-γ -lyase,CSE)和半胱氨酸转移酶催化作用下产生的。心血管组织内 H2S主要通过 CSE催化产生。H2S在血管组织以L-半胱氨酸为底物经胱硫醚-γ-裂解酶 (cystathionine-γ-lyase,CSE)分解代谢而生成[2]。H2S可通过抑制MAPK信号途径抑制血清及内皮素诱导的血管平滑肌细胞增殖,通过激活caspase-3途径诱导主动脉平滑肌细胞凋亡,维持血管正常结构和功能[3]。因此,H2S可能减轻动脉粥样硬化的发展。然而,食饵性大鼠 AS进程中及应用有氧游泳运动后,CSE/H2S系统的变化情况尚不清楚。本研究在构建高胆固醇饮食诱导的大鼠食饵性AS模型的基础上 ,检测了 CSE活性及 H2S生成量的变化 ,并应用有氧运动进行调节,旨在探讨食饵性 AS进程中 ,CSE/H2S的变化规律,并探讨有氧运动后对CSE/H2S系统的影响。

1 材料和方法

1.1 材料与主要试剂

5’-磷酸吡多醛美国、PPG(炔丙基甘氨酸, p ropargy1-gycine,PPG内源性 H2S合成酶的抑制剂)及硫氢化钠 (hydrogen sulfide)均购于 Sigma公司。721A型分光光度计购于上海第三分析仪器厂。雄性 SD大鼠购自重庆市第三军医大实验动物实验中心。

1.2 AS模型的制备及动物实验分组

雄性 SD大鼠16只,体重 180-200g,喂高脂饲料(2%胆固醇、10%蛋黄粉、5%猪油和 83%基础饲料)8周后,随机分为两组M和N,游泳运动M和不运动N,每组 8只。同时选取 8只雄性 SD大鼠为正常对照组 C,给予普通饲料 120-140g/d喂养 8周。

1.3 各项生化指标的测定

于实验开始、8周末、禁食 12h以上,经摘眼球取血备用。采用沉淀漂浮酶联法检测血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)的含量。试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 血浆 H2S浓度测定

测定采用去蛋白法[4]在试管中加入 0.5 ml 1%醋酸锌,然后加入 0.1 ml血浆标本,振荡混匀,使血浆中的硫离子与醋酸锌充分反应形成硫化锌沉淀而固定下来;再依次加入 20 mmol/L对苯二胺盐酸盐 0.5 ml和 30 mmol/L三氯化铁 0.5 ml,室温孵育 20 min使之充分显色。再加入 10%三氯醋酸 1 ml使蛋白沉淀下来,加 2.5 ml蒸馏水补足体积至 5 ml。6 000 r/ min离心 5 min,吸取上清液,用分光光度计在波长670 nm处检测上清液的吸收度(A)值。根据 H2S标准曲线计算上清液中 H2S的含量。

1.5 主动脉组织中硫化氢合酶活性的测定

取新鲜剥离的大鼠主动脉或左心室肌组织 50 mg,去除外膜脂肪,用 50mmo/L磷酸缓冲液 (pH 6.8)在 Polytron匀浆器制备 10%(质量分数)组织匀浆,考马斯亮蓝蛋白定量后加入反应液(100mmol/L磷酸缓冲液 pH7.4,10mmol/L左旋半胱氨酸,2mmol/L磷酸吡多醛),移至反应瓶,反应瓶中央的吸收孔中加入 0.5mL 1%(质量分数)醋酸锌,并以滤纸浸入其中,以加大吸收面积。反应瓶在封口前用氮气吹 20s,将反应瓶于 37℃水浴中孵育 90min,加入 0.5mL 50%三氯乙酸 37℃孵育 60min终止反应,反应瓶中央孔的液体加入 3.5mL水,20mmol/L对氨基二甲基苯胺盐酸盐0.5mL、30mmol/L三氯化铁0.4mL,室温静置20min后于 670nm读取吸光度(A)值[5]。配制NaHS作出标准曲线,计算出组织中 H2S生成率,结果以 nmol/(min ·mg)表示。

1.6 统计学分析

所有数据均用(x±s)表示,采用 SPSS15.0统计软件和Origin7.5软件对实验数据进行统计学处理。

2 结果

2.1 血脂检测结果

与正常对照组相比较,模型组M、N血脂水平明显升高(P<0.01),游泳运动后,模型组M血浆 TC、TG、LDL水平明显下降(表 1)。

表 1 实验各组血脂测定结果(c/mmol·L-1±s)

表 1 实验各组血脂测定结果(c/mmol·L-1±s)

﹡ P<0.01vs对照组;△P<0.01vs模型组

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2.2 有氧运动对血浆 H2S含量的影响

模型组M、N血浆H2S含量大幅度减少,与对照组C相比较差异有显著性。第 8周后,运动模型组M血浆 H2S含量有所增加,并且高于了对照组水平 (见图1)。

图 1 实验各组血浆 H2S测定结果(c/umol/L)

2.3 有氧运动对主动脉组织 CSE活性的影响

对照组 C在随时间的变化中,主动脉组织 CSE活性没有明显的变化。模型组M、N随着时间,主动脉组织 CSE活性不断的降低,但是通过一定时间的有氧运动后,运动模型组M主动脉组织 CSE活性又不断增加,并且高于了对照组 C(见图 2、3)。

3 讨论

动脉粥样硬化是以富含脂肪的斑块在大动脉壁聚积为特征的系统疾病,是一种严重危害人类健康的疾病。动脉粥样硬化病因病理复杂,目前尚未完全阐明。大量研究证明,氧化应激是 AS的重要致病因素,因此,抗氧化物质为 AS的治疗带来了新的曙光。血管系统中内源性气体信号分子是体内重要的抗氧化体系,影响AS发生发展的许多病理过程。气体信号分子合成酶与AS的关系已成为研究的热点,具有可诱导性的气体信号分子合成酶的调控有望成为AS防治的新手段。90年代后期研究表明,中枢的内源性 H2S具有调节学习记忆和调节下丘脑 -垂体 -肾上腺素轴的功能,被认为是一种非典型的神经递质[6]。近年发现心血管组织表达CSE并利用L-Cys生成H2S,内源性的H2S可开放 VSMC质膜上 KATP通道 ,导致细胞膜超极化 ,舒张血管 ,降低血压[7];并可通过抑制丝裂素活化蛋白激酶途径抑制 VS MC的增殖[8],通过激活 Caspase-3途径促进 VS MC凋亡[9]。心肌组织表达 CSE及MPST,产生的 H2S可通过 KATP通道开放产生负性肌力作用[10]。实验研究证实 ,高血压、心肌缺血、肺动脉高压及休克等心血管病变时 ,心血管CSE/H2S通路明显改变 ,给予 H2S的供体 (NaHS)或 CSE抑制剂 (DL-p r opargylglycine)后皆明显影响疾病的发病过程及预后 ,提示内源性 H2S可能是心血管调节的新型气体信号分子[11-13]。胱硫醚 -γ-裂解酶(CSE)[14]是体内清除同型半胱氨酸的关键酶,各种原因引起的 CSE活性降低、均可导致高同型半胱氨酸血症。血液中高浓度的同型半胱氨酸可通过损伤血管内皮细胞、改变血液的凝固状态和血小板功能、刺激血管平滑肌细胞增殖和促进低密度脂蛋白氧化等参与 As的发生发展过程。

运动可以造成氧化应激,但有规律有计划的体育运动可以通过基因水平上调节氧化还原信号增强机体抗氧化能力。最近研究发现,运动能诱导气体信号分子相应的合成酶合成,对动脉粥样硬化病理形成和发展具有阻抑作用。利用气体信号分子作为治疗AS手段已引起人们关注。然而气体信号分子合成酶的诱导剂大多具氧化毒性,对机体有损伤。转基因虽有效,但在临床却不太可行。而有氧运动在防治 AS的积极作用已被部分基础研究和临床实践所证实,有氧运动可通过多种途径和机制对AS起防治作用。关于运动对气体信号分子系统的影响,为数不多的研究表明,运动可诱导血管内皮、平滑肌、骨骼肌、白细胞中NOS、HO -1、CSE表达增多[15]。提示运动促进 NOS、HO-1、CSE的合成,可能是运动改善 AS的另一机制,直接证据尚需实验证实[16-18]。目前还发现了 H2S与 NO和CO不同的是,H2S通过激活血管平滑肌细胞中 K (ATP)通道及依赖细胞外 Ca2+的内流来发挥作用,而NO和CO则是通过激活环磷鸟苷 cG MP通路和Ca2+依赖性钾离子通道发挥扩血管作用,并抑制平滑肌细胞的增殖。细胞信号转导重要的特征之一是不同信号转导途径之间通过复杂的相互作用形成信号网络,以整合调控的模式精确调控细胞活动[19-21]。那么AS时,NOS系统,HO系统同时受损,H2S/CES系统起代偿作用,而此时运动对两者的调节有何异同;运动时H2S/CES又是通过何种机制影响AS;运动对它的表达又有何影响等,将成为是运动医学的研究热点,亟待全面而深入地探讨,对预防和治疗 AS将有着更为积极意义。

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Effect of the CSE/H2S System of Exercise Intervention on Atherosclerosis of the Experimental SD Rat

L iu Fang
(Physical Education College,SouthwestUniversity,Chongqing 400715)

Objective:To investigate changes in the CSE/H2S system in the process of atherosclerosis aswell as the effect of aerobicson the system.Methods:16 SD ratsof exper imental atherosclerosis are made into models and randomly divided into theM group and the N group,withM group swimming 30 minutes each day for eightweeks on end,while the N group not doing any exercise.At the same time,the control group is fed normally.Then levelsof serum lipids and serum H2S are deter mined by the immunohistochenistry technique.Results:at the end of the eighth week,compared with the control group,the blood fat level significantly increases,while the level of plasma H2S and the expression of CSE decrease in theM and N groups.

atherosclerosis,cystathionine-r-lyase,hydrogen sulphide,aerobics

G804.2

A

1001—9154(2010)03—0073—04

book=73,ebook=94

G804.2

A

1001—9154(2010)03—0073—04

刘芳 (1972—),女,硕士,西南大学讲师,研究方向:体育教学与训练。

2009—12—10