难治性颞叶癫痫患者颞叶皮层 GRP78、caspase4的表达

刘功禄, 赵永波, 赵圣杰, 肖 倩, 沈 原

动物模型及临床病理标本研究均表明,癫痫反复发作可导致脑内神经元凋亡[1,2]。死亡受体活化(外源性途径)和线粒体损伤途径(内源性途径)是细胞内两条经典的凋亡途径,大多数对癫痫后引起的神经元凋亡的研究集中于这两条途径。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)启动的凋亡途径是近年才发现的一种新的凋亡途径。但 ERS在癫痫后脑损伤中的作用机制还远未阐明。葡糖糖调节激酶(glucose regulated protein,GRP78)是内质网经典的标志分子,而 caspase4在人类 ERS反应性细胞凋亡途径中具有关键性作用。为探讨 ERS在癫痫脑损伤中的作用,我们采用免疫组化及 Western blot法分别检测了难治性颞叶癫痫手术切除的颞叶皮层脑组织 GRP78、caspase4的表达。

1 资料与方法

1.1 临床资料 32例难治性颞叶癫痫患者均来自 2008.1～2009.1上海交通大学附属仁济医院和上海曲阳医院神经外科住院手术患者,其中男 19例,女 13例;年龄 6～41岁,平均 27.9±7.8岁;病程 4～32年,平均 13.5±7.5年;发作频率 3～55次/m,平均 12.4±13.5次/m。患者都有癫痫的典型表现,发作类型符合国际抗癫痫联盟 1981年有关癫痫发作分类的规定,并符合以下条件:(1)用 2种以上抗癫痫药,正规治疗 2年以上,与发作基线相比,发作无明显减少;(2)头部 CT或 MRI扫描除海马硬化外无颅内占位性病变或其他神经系统疾病;(3)术前 24h头皮脑电图及术前 1w放置硬膜下电极皮层脑电图监测,癫痫灶定位于一侧的颞叶皮层和(或)海马;(4)手术中没有发现除癫痫外其他神经系统病变和可能引起癫痫发作的病因;(5)术后组织病理证实为神经元变性、胶质增生等非特异性改变;(6)患者及家属术前签署知情同意书。其中复杂部分性发作 22例,全身强直-阵挛发作 5例,复杂部分性发作继发全身强直-阵挛发作发作 5例。对照组 15例,男 9例,女 8例,年龄构成与病例组接近,均无癫痫发作史及家族史。其中 5例为颞叶前中部脑血管畸形手术切除获得的颞叶脑组织,15例为脑外伤颅内高压减压术术中采集颞叶脑组织,病理切片检查未见组织异常,所有患者均签署知情同意并且标本获取得到医院伦理委员会批准。

1.2 标本收集和保存 癫痫组和对照组患者颞叶皮层脑组织在术中采集,标本取出后部分立即放入液氮中,后放置在 -80℃低温冰箱中保存备用,部分置于 4%多聚甲醛中固定 48h,随后常规石蜡包埋切片,常温保存备用。

1.3 免疫组化检测 癫痫组和对照组脑组织常规石蜡包埋后(癫痫组,n=14;对照组,n=6),石蜡切片机行连续冠状切片,片厚 5μm。每个标本随机切 10片,然后每份随机抽取 2片组成新待测样本。采用 SP免疫组化法进行检测(UltraSensitiveTM S-P免疫组化试剂盒,福州迈新生物技术有限公司),切片经脱蜡抗原热修复,血清封闭液封闭后,滴加一抗 GRP78(兔单克隆抗体,1∶50,Cell Sigaling Technology公司)、Caspase4(兔多克隆抗体,1∶50,Abcam公司),4℃孵育过夜,然后滴加生物素标记的羊抗兔二抗室温孵育 30min,DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片。用 PBS代替一抗作阴性对照。以胞质染成棕黄色为阳性。每张切片采用 AxioVision 3.1光学显微镜联合 Axioplan 2显微成像系统进行摄片(Carl Zeiss公司),应用 Imagepro-Plus图像分析系统测定光密度(optical density,OD)值。

1.4 Western blot检测 脑组织样本(癫痫组,n=18,对照组,n=9)采用核-胞浆蛋白裂解液裂解蛋白,Bradford法蛋白定量。每泳道上样 50μg,8%SDS-PAGE凝胶电泳分离后湿转法电转移至 PVDF膜。封闭后加入一抗(GRP78,1∶1000;Caspase4,1∶500)及内参照 GAPDH(鼠单克隆抗体,1∶2000),4℃孵育过夜后二抗室温孵育 45min。ECL发光试剂反应 1min,暗室内 x线片曝光,显影,定影。获得的条带胶片用 Acer扫描仪扫描,应用 Imagepro-Plus图像分析系统测定 OD值,用同一标本内参 GAPDH的光密度值进行校正,按公式 OD相对值 =目的条带表达强度/GAPDH表达强度,计算出相对值进行统计分析。

2 结 果

2.1 免疫组化结果 在对照组正常颞叶脑组织中仅见少量 GRP78阳性神经元,癫痫组 GRP78阳性神经元明显增多,主要在神经元的胞浆内表达,经OD值比较,两组间差异有统计学意义(t=15.464,P＜0.05)(见表1、图1)。在对照组检测到较弱 Caspase4表达,而癫痫组 caspase4免疫反应明显增强,阳性神经元明显增多,主要在神经元的胞浆内表达,经 OD值比较,两组间差异有统计学意义(t=14.740,P＜0.05)(见表2、图2)。

2.2 Western blot结果 对照组 GRP78、Caspase4蛋白条带较弱,癫痫组 GRP78、Caspase4蛋白条带较对照组明显增强(见图1、图2),两组两种蛋白 OD相对值比较差异有统计学意义(GRP78,t=12.913,P＜0.05;Caspase4,t=9.956,P＜0.05)(见表3、表4)。

表1 GRP78蛋白免疫组化染色结果±s)

表1 GRP78蛋白免疫组化染色结果±s)

与对照组比较t=15.464,*P＜0.05

癫痫组对照组1460.767±0.077*0.242±0.031

表2 Caspase4蛋白免疫组化染色结果±s)

表2 Caspase4蛋白免疫组化染色结果±s)

与对照组比较t=14.740,*P＜0.05

癫痫组对照组1460.712±0.073*0.225±0.035

表3 GRP78 Western印迹结果±s)

表3 GRP78 Western印迹结果±s)

与对照组比较 t=12.913,*P＜0.05

癫痫组对照组1890.713±0.017*0.498±0.037

表4 Caspase4 western印迹结果±s)

表4 Caspase4 western印迹结果±s)

与对照组比较,t=9.956,*P＜0.05

癫痫组对照组1890.519±0.025*0.315±0.043

图1 GRP78在难治性颞叶癫痫患者颞叶脑组织中的表达

图2 Caspase-4在难治性颞叶癫痫患者颞叶脑组织中的表达

3 讨 论

颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)是难治性癫痫中最常见的类型,约占难治性癫痫的 60%～70%。癫痫反复发作可导致脑内神经元凋亡和多种凋亡相关基因的表达[3]。

内质网(endoplasmic reticulum,ER)是哺乳细胞中一种重要的亚细胞器,也是重要的钙离子贮存库。它是调节蛋白质合成及合成后折叠、聚集的场所,是调节细胞的应激反应及细胞钙水平的场所。在某些应激情况下,内质网的微环境发生改变,蛋白质的折叠受到影响,导致大量未折叠或错误折叠的蛋白质堆积于内质网内,由此引起一系列分子伴侣(如GRP78)和折叠酶表达上调为标志的应答反应,称为非折叠蛋白质反应(unfolded protein response,UPR),整个应激及其激发的应答过程称为 ERS[4]。内质网通过激活 UPR以保护由 ERS所引起的细胞损伤,恢复细胞功能。然而 ERS持久或过度,就会诱导细胞损伤、凋亡[5]。癫痫发作导致机体氧耗增加、呼吸暂停和血管舒缩功能异常而继发脑缺血、缺氧反应,诱导缺血缺氧性脑损伤。这种病理状态下,GABA减少、神经元突触后抑制作用减弱,NMDA受体通道开放增加,引起神经元兴奋毒性损伤,而细胞膜去极化导致电压依赖性 Ca2+通道开放,导致突触前兴奋性氨基酸释放增加,其与突触后相应受体结合后又导致细胞外 Ca2+内流,这一系列病理生理过程均可诱发内质网应激。Henshall等[6]认为癫痫的病理生理过程可以激活触发 ERS,其诱导启动的UPR保护性适应和损伤机制均参与了惊厥诱导神经元损伤过程,具体机制尚不清楚。

GRP78是存在于内质网上最多的应激蛋白,又称葡萄糖调节蛋白,属于热休克蛋白家族。其主要功能是帮助新生多肽链的折叠、装配和转运,在缺血缺氧、钙离子失衡、氧化应激等各种应激环境下,GRP78的表达量显著增高,协助变性蛋白进行重新装配和跨膜转运,缓解内质网压力。因此,GRP78被认为是内质网应激反应的标志性分子[7]。本研究检测了顽固性颞叶癫痫患者癫痫灶内 GRP78的表达。免疫组化和 Western印记结果显示癫痫组GRP78较对照组表达明显增加(见表1、表3、图1),提示癫痫反复发作诱发了内质网应激。GRP78通过促进蛋白质的正确折叠提高内质网的应激反应能力,在癫痫发作中起到保护神经元、对抗凋亡的作用。当这些机制不足以恢复内质网平衡时,细胞将启动内质网相关的凋亡程序,清除不健康的细胞,所以 GRP78的表达反映了细胞的损伤情况和应激能力,对决定细胞的结局如抵抗、适应、损伤或凋亡等有重要作用。将来通过干预 GRP78的表达水平,有望成为癫痫发作后脑损伤的新的脑保护药物,甚至成为治疗顽固性癫痫新的药物靶点。

Caspase-12作为 ER膜上的促凋亡分子,是 ERS介导的细胞凋亡关键分子,其活化是凋亡的中心环节,在死亡受体或线粒体凋亡途径中不被活化。但caspase-12仅在某些啮齿类哺乳动物中存在,在人类由于 caspase-12基因存在几种突变子使其功能失活[8]。有学者发现,人类基因中的 caspase-4在人类ERS反应性凋亡途径中起到 “caspase-12”的作用[9]。为了研究 caspase4是否参与了癫痫脑损伤,我们应用免疫组化和 Western印记技术检测了顽固性颞叶癫痫患者癫痫灶脑组织 caspase-4的表达水平。结果显示癫痫组 caspase-4表达水平明显增加,Western印记还检测到了 caspase-4的活化形式(cleaved)。因此,本研究提示 caspase-4可能通过内质网应激途径介导了癫痫后神经元凋亡损伤,但其具体功能机制尚需进一步研究。caspase-4可能与caspase-12有类似的激活机制:内质网应激可能通过需钙蛋白酶对原 caspase-4裂解或通过 GRP78/caspase-7复合物介导的机制而使 caspase-12激活。另外,肿瘤坏死因子受体相关因子 2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2)能与caspase-4相互作用,切割 caspase-4使其活化。活化的 caspase-4进一步激活 caspase-9和 caspase-3,引起细胞凋亡。

本实验结果提示难治性颞叶癫痫反复发作后诱发了内质网应激,表现为 GRP78表达增加,同时内质网特异性凋亡蛋白酶 caspase-4表达增加、活化,可能介导了癫痫后神经元凋亡损伤。但关于内质网应激在癫痫脑损伤中的作用机制研究还刚刚起步,还有许多问题亟待解决。随着内质网应激在癫痫脑损伤及其发病机制中的深入研究,人们必将能找到有效的内质网应激诱导的细胞损伤,从而为癫痫的治疗寻找新的途径。

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