含H5N1禽流感病毒核酸序列的病毒样颗粒的制备及应用*

戚宇华,崔仑标,史智扬,葛以跃,李 显,张文帅,单 军,汪 华

含H5N1禽流感病毒核酸序列的病毒样颗粒的制备及应用*

戚宇华,崔仑标,史智扬,葛以跃,李 显,张文帅,单 军,汪 华

目的构建耐RNase酶的内含禽流感病毒 H5N1亚型部分核酸序列的病毒样颗粒。方法构建中间载体pET32a-MS2,将禽流感病毒H5N1亚型的HA、NA和M基因片断连接到中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA和pET32a-MS2-M,分别转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒。结果表达载体经PCR、酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。电镜观察到了病毒样颗粒,荧光定量RT-PCR试验表明颗粒稳定性良好。结论成功构建了含禽流感病毒H5N1部分核酸序列的病毒样颗粒且稳定性良好,可作为禽流感H5N1亚型RNA检测的标准品和质控品。

MS2噬菌体;禽流感病毒 H5N1;病毒样颗粒;原核表达

近年来禽流感病毒在世界范围内的流行引起了人们的高度重视,每年冬春季是禽流感爆发的高峰期,其中H5N1亚型的死亡率特别高,为高致病性禽流感病毒〔1-2〕。除禽类外它可以感染包括人在内的许多哺乳动物〔2-3〕。2009年初,中国就出现了8例人感染禽流感H5N1亚型的散发病例,其中5人死亡,给人民生命财产造成重大危害。对禽流感病毒的快速实验室检测并确诊,对于挽救病人生命,及时处理续发病例,有效控制疾病的流行起着非常重要的作用。目前,世界各国广泛应用RT-PCR的方法来检测禽流感H5N1亚型病毒感染的临床标本〔3-4〕。然而RNA病毒在PCR基础上的定性和定量检测中,常会有假阴性的出现,在临床检测中人们关心的是检测试剂盒中的阳性是否有传染性,或者能否起到全程监控的作用。所以对 H5N1亚型病毒的核酸测定质控品和标准品的研制尤为重要。Armored RNA的技术是解决标准品的途径之一。本研究我们采用Armored RNA的设计方法〔5-7〕制备了H5N1禽流感病毒血凝素基因HA,神经氨酸酶基因NA和M蛋白基因片断的病毒样颗粒。这些病毒样颗粒能有效抵抗RNase酶引起的降解,可作为检测H5N1禽流感病毒基因RT-PCR的质控品,并能对从核酸提取到RT-PCR检测全过程起到有效的监控作用。

1 材料和方法

1.1 病毒来源 禽流感H5N1亚型病毒毒株由本实验室保存。

1.2 主要试剂 BL21(DE3)E.coli、Top10E.coli及pET32a质粒为本室保存菌株,pMS27质粒由厦门大学惠赠。Taq DNA聚合酶、DNA连接酶试剂盒 、Hind III、BamH I 试剂盒 、质粒纯化试剂盒 、核酸提取试剂盒(TaKaRa公司);胶回收试剂盒(O-mega公司);OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen公司);荧光定量OneStep Probe Master Mix(Qiagen公司)。

1.3 方法

1.3.1 引物设计 根据大肠杆菌MS2噬菌体装配蛋白和壳蛋白基因和禽流感病毒H5N1亚型的 M蛋白基因,血凝素基因HA和神经氨酸酶基因NA序列,设计引物,序列如下:

MS2 的 上 游 引 物 为 5′-ATATGGATCCCCCTT TCGGGGTCCTGCTC-3′,下游 引物 为 5′-CGCAAGCT TTCT TCGACATGGGTAATCCT-3′,目的扩增片段为1 700bp;M的上游引物为5'-CAGAAGCTTGACCAATCCTGTCACCTCTGAC-3',下 游 引物 为 5'-GTGAAGCTTGGGCATTCTGGACAAAGCGTCTACG-3',目的扩增片段为104bp;HA的上游引物为 5'-GCGGAAGCT T TGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGT-3',下游引物为 5'-GTGAAGCTT TGAT TGCCAGTGCTAGGGAACT-3',目的扩增片段为158bp;NA的上游引物为5'-GAGAAGCTT TGT TGCTTGGTCAGCAAGTGCT-3',下游引物为 5'-GGCAAGCT TGAGTTCTCAGTATGTTGT TCC-3',目的扩增片段为152bp。所有引物均在Primer Premier 5软件上设计引物并在上、下游引物 5'端引入GGATCC(BamH I酶切位点)和AAGCTT (Hind III酶切位点),并由上海生工公司合成。病毒样颗粒荧光定量PCR检测的引物探针由中国预防控制中心提供。

1.3.2 中间载体pET32a-MS2的构建 以pMS27质粒为模板PCR扩增MS2基因片段,PCR体系中含上下游引物各2.5 pmol/L,TaqDNA Polymerase 2.5U,dNTP 2.5mmoL/L,模板 1μ L,MgCl245 mmoL/L,双蒸水补足 30μ L。PCR反应条件为:95℃变性 5 min,然后 94℃30 s,57℃30 s,72℃1 min 30 s,进行35个循环,最后72℃延伸10 min。扩增产物经Hind III和BamH I双酶切后产物1.0%琼脂糖凝胶电泳,Omega胶回收试剂盒回收MS2基因片段。和同样双酶切的pET32a载体16℃连接1 h,连接产物转化TOP10感受态细胞,涂板后挑取单克隆培养扩增,提取质粒进行PCR及酶切鉴定,鉴定为阳性的重组载体命名为pET32a-MS2。

1.3.3 原核表达载体pET32a-MS2-M,pET32a-MS2-HA和 pET32a-MS2-NA的构建 分别以禽流感H5N1亚型病毒毒株 RNA为模板,OneStep RT-PCR试剂盒扩增3种基因片段,RT-PCR反应条件为:50℃30 min,95℃变性15 min,然后94℃30 s,58℃30 s,72℃30 s,35个循环,最后72℃延伸10 min。扩增产物经Hind III单酶切后2.0%琼脂糖凝胶电泳,Omega胶回收试剂盒分别回收M、HA和NA的基因片段,与同样Hind III单酶切的pET32a-MS2载体连接。连接产物转化TOP10感受态细胞,涂板后挑取单克隆培养,提取质粒进行PCR及酶切鉴定,并送上海生工测序,序列正确的重组载体分别命名为 pET32a-MS2-M,pET32a-MS2-HA和pET32a-MS2-NA。

1.3.4 病毒样颗粒的诱导表达 将测序正确的上述3种质粒分别转化表达菌株BL21(DE3),将阳性克隆菌株接种于氨苄抗性的LB液体培养基中,37℃振荡培养至OD600=0.5～0.6,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,诱导表达6 h后,离心收集菌体,超声破碎后,离心取上清到另一干净的离心管,得到粗制的病毒样颗粒产物。

1.3.5 病毒样颗粒荧光定量RT-PCR检测 取适量粗制病毒样颗粒溶液250μ L用Takara核酸提取试剂盒提取RNA,3种病毒样颗粒RNA用Qiagen OneStep Probe Master Mix检测试剂盒,在 Roto Gene 3000做荧光定量PCR,PCR反应条件为:50℃30 min,95℃变性15 min,然后 94℃15 s,60℃1 min,72℃30 s,进行45个循环。检测定量RT-PCR的结果。

1.4 病毒样颗粒的纯化和形态观察 取适量粗制病毒样颗粒溶液NA加入DNase I和RNase A(终浓度 1μ g/mL),室温温育 30 min后离心(4℃,10min,11 000g)去除细胞碎片。上清与42%的氯化铯溶液混匀,配制成p=1.4550g/mL的溶液,日立SCP85H超速离心机 RPS40T转头做梯度离心(4℃,48 h,160 000g),离心管底部扎孔,分段收集梯度。蛋白核酸分析仪选取目标梯度加PBS混匀,离心(4℃,2 h,110 000g)去除氯化铯,适量PBS悬浮。将悬浮液用2%的磷钨酸负染,H7650透射电镜观察纯化的病毒样颗粒。

1.5 病毒样颗粒的稳定性试验 各取100 μ L病毒样颗粒溶液NA加入过量的RNaseA,分别放置在37℃,4℃,-20℃,放置 1d,7d,14d和 30d,然后提取 RNA,再用 Qiagen OneStep Probe Master Mix检测试剂盒,在Roto Gene 3000做荧光定量PCR。PCR反应体系中上下游引物及探针各5 pmol/L,RT-Mix Enzyme 0.25μ L,模板 5μ L,双蒸水补足25μ L。PCR反应条件同上。

2 结果与分析

2.1 中间载体pET32a-MS2的鉴定 将连接产物pET32a-MS2转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,随机挑3个单克隆进行PCR鉴定,结果全为阳性。取其中1个阳性克隆摇菌提取质粒,用Hind III和BamH I双酶切,电泳鉴定有约1 700 bp的目的条带(图1)。结果表明MS2基因片段正确克隆到载体pET32a上。

图1 重组质粒pET32a-MS2的酶切鉴定Fig.1 Enzymolysis identification of the recombinant plasmid pET32a-MS2

2.2 表达载体 pET32a-MS2-M,pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA的鉴定 将连接产物pET32a-MS2-M,pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA分别转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞。挑取单克隆进行PCR鉴定,结果全为阳性。分别取其中一阳性克隆摇菌提取质粒用Hind III单酶切,电泳鉴定有100 bp左右的目的基因条带,M为104 bp,HA为158 bp,NA为152 bp;用Hind III和BamH I双酶切,电泳鉴定有100bp左右的目的基因条带外,同时有 1 700 bp的MS2基因条带(图2),结合测序结果表明M,HA和NA片段正确克隆到载体pET32a-MS2上。

图2 pET32a-MS2-M,pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA的酶切鉴定Fig.2 Enzymolysisidentification ofexpression vector pET32a- MS2-M, pET32a- MS2-HA, and pET32a-MS2-NA

2.3 病毒样颗粒的荧光定量RT-PCR结果 3种病毒样颗粒溶液提取RNA,再用Qiagen荧光定量试剂盒扩增3种禽流感病毒基因,荧光定量 RTPCR结果均为阳性(图3),表明病毒颗粒含有禽流感H5N1亚型的M,HA和NA的RNA序列。

图3 病毒样颗粒荧光定量RT-PCR鉴定结果Fig.3 The realtime RT-PCR result of virus-like particles

2.4 病毒样颗粒的形态观察 粗制的病毒样颗粒NA经氯化铯梯度离心后,PBS离心去除氯化铯后,经透射电镜观察,可见表达产物为直径50nm左右的圆形颗粒,即诱导表达得到的病毒样颗粒(图4)。

图4 病毒样颗粒的电镜观察结果Fig.4 The electron microscope result of virus-like particles

2.5 病毒样颗粒的稳定性 取病毒样颗粒NA溶液加入过量的 RNaseA消化后,分别放置在37℃,4℃,-20℃,放置 1d,7d,14d和 30d,得到几种不同条件下的样品,分别提取RNA,荧光定量RT-PCR得到不同样品的Ct值(图5)。结果表明,在-20℃时,放置超过30 d Ct值基本不变,而放置在4℃和37℃条件下的样品随时间增长Ct值略有增加,稳定性试验证明制备的病毒样颗粒能够抵抗核糖核酸酶引起的RNA降解,稳定性良好。

图5 病毒样蛋白颗粒的稳定性分析Fig.5 Analysis of stability of virus-like particles

3 讨 论

20世纪来全世界范围爆发人感染禽流感病毒越来越多。1997年我国香港发现的H5N1亚型高致病性禽流感引起18人感染并导致6人死亡更引起全世界人民的高度重视〔8〕。而世界卫生组织(WHO)也报道了多起人感染高致病性禽流感H5N1,一些在家庭成员中人感染人的病例在越南和台湾也有报道〔9〕。目前RT-PCR的核酸检测是主要的快速检测方法。在禽流感H5N1亚型的核酸检测中还缺乏从核酸提取到定量PCR的全程阳性质控品。

近年来运用Armored RNA的技术来制备质控品越来越多。在早期的研究中发现MS2噬菌体基因编码成熟酶蛋白、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白4种蛋白分子〔10〕。MS2噬菌体的外壳蛋白与操作子RNA一段茎环结构有特异性的相互作用,使噬菌体外壳蛋白组装成病毒样颗粒,基因组RNA也被包装进去〔11-12〕。将MS2噬菌体的外壳蛋白等基因和外源性基因片段插入到原核表达载体中,这一载体能够将这些片段转录成RNA,并利用载体上MS2外壳蛋白基因合成的外壳蛋白将重组RNA装配成球状的 RNA蛋白复合体,即病毒样颗粒〔13〕。本研究在此基础上,首先构建了中间载体pET32a-MS2,然后将禽流感病毒H5N1亚型的M蛋白基因、血凝素基因HA、神经氨酸酶基因NA序列分别克隆到载体的噬菌体基因的下游,进行原核表达得到含有禽流感H5N1亚型的M、HA和NA的基因序列的病毒样颗粒。

本试验室构建这种禽流感H5N1亚型RNA病毒样颗粒有着极重要的意义。首先解决了安全性问题,这种重组的病毒颗粒无传染性,可广泛应用于普通试验室检测。此外这种病毒样颗粒具有耐RNase酶的特性,它比较稳定,在4℃、37℃保存30d后提取RNA做荧光定量RT-PCR仍然没有降解。很好地解决了普通RNA作为质控品很快降解且不易保存和运输的稳定性问题。由于这种病毒颗粒是蛋白外壳包裹核酸,与大多数RNA病毒相似,可以与样品一样经历核酸提取,反转录,PCR扩增的全过程,避免了假阴性的结果。本研究采用分子克隆和原核诱导表达构建的禽流感H5N1亚型RNA病毒样颗粒可以在RT-PCR、荧光定量RT-PCR的检测中作为稳定的质控品和标准品,在RNA检测中具有很大的发展前景。

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Preparation of the RNAse-resistant virus particles containing the partial gene fragments of avian influenza virus H5N1 and its application

QI Yu-hua,CUI Lun-biao,SHI Zhi-yang,GE Yi-yue,LI Xian,ZHANG Wen-shuai,SHAN Jun,W ANG Hua

(Microbiological laboratory,Jiangsu Provincial Center for Diseases Prevention and Control,Nanjing210009,China)

To prepare the RNAse-resistant virus particles containing the partial gene fragments of avian influenza virus H5N1 for use as RNA standard and control in RNA virus detection,the genes coding the coat protein and maturase ofE.colibacteriophage MS2 were amplified by PCR and then cloned into prokaryotic expression vector pET32a to construct the intermediate vector pET32a-MS2.In addition,the gene sequences coding hemagglutinin(HA),neuraminidase(NA)and M protein of the H5N1 virus were also cloned separately to the down-stream of plasmid pET32a-MS2,thus constructing the prokaryotic expression vectors pET32a-NS2-HA,pET32a-MS2-NA and pET32a-MS2-M.These recombinant plasmids were then transformed separately toE.coliBL21(DE3)with induction by IPTG.to express the virus-like particles.The virus-like particles observed under electron microscopy were identified by RT-PCR,while their stability was confirmed by real-time RT-PCR.In this way,the virus-like particles were successively constructed and identified through PCR amplification,enzymolysis identification and sequencing analysis.These virus-like particles observed under electron microscopy appeared to be circular in shape with a diameter of about 50 nm.Their stability was proved to be rather good.From these observations,it is apparent that these virus-like particles can be used as RNA standard and quality control in the detection of avian influenza virus H5N1.

bacteriophage MS2;H5N1 avian influenza virus;virus-like particles;prokaryotic expression vector

R373.1

A

1002-2694(2010)01-0029-04

*江苏省国际科技合作项目(BZ2008068)

史智扬,Email:njyhqi@126.com

卫生部肠道病毒重点实验室,江苏省疾病预防与控制中心检验科,南京 210009

2009-10-09;

2009-12-03