大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表达质粒的构建及表达*

易亮衡,秦永伟,陈金铃,朱丹丹,何兴新,段义农

2.湖北省黄石市疾病预防控制中心,黄石 435000

大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表达质粒的构建及表达*

易亮衡1,2,秦永伟1,陈金铃1,朱丹丹1,何兴新1,段义农1

目的构建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞COS-7中的有效表达。方法以含有p55全长基因的质粒为模板,通过PCR扩增p55基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经酶切后再将p55基因重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入COS-7细胞,RT-PCR检测其基因转录情况,SDS-PAGE鉴定其表达相应的目的蛋白质情况。结果成功扩增了p55基因片段,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDSPAGE方法证实该片段能在COS-7细胞中有效表达目的蛋白质。结论成功构建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究奠定了基础。

大鼠源肺孢子菌;p55基因;真核表达

2.湖北省黄石市疾病预防控制中心,黄石 435000

肺孢子菌(Pneumocystis)是一类重要的机会性致病真菌,广泛存在于人和哺乳动物肺组织内,可以引起肺孢子菌肺炎(Pneumocystispneumonia,PCP)。PCP目前已成为艾滋病患者最常见的机会性感染,并是其致死的主要原因〔1〕。此外,恶性肿瘤、器官移植术后、恶性营养不良、大量的免疫抑制剂、抗肿瘤药物的应用以及放射线照射等造成机体免疫功能低下也极易诱发本病〔2〕。PCP一旦发生,病情进展迅速,病死率极高,不经治疗几乎100%死亡,故越来越受到国内外的重视。广泛预防服药使抗药性出现的比率在逐渐增高,预防用药尚不能完全预防肺孢子菌肺炎的发生。由于缺少可靠、稳定的连续的体外培养体系,迄今体外培养技术难以提供大量肺孢子菌抗原,用肺孢子菌可溶性抗原或活肺孢子菌进行免疫在实际工作中受到限制〔3〕。因此开展重组抗原的研究将是PCP免疫预防的一个重要课题。大鼠源肺孢子菌(pneumocystisof rats)抗原p55(Mr 55 000)是Pc的主要抗原之一。早期感染Pc宿主的肺泡灌洗液中可检测出该抗原。Smulian 等〔4〕和 Theus等〔5〕发现重组 p55 蛋白能刺激宿主产生免疫反应。基于p55抗原的研究,p55抗原可能成为PCP免疫预防的一个重要途径。本研究采用基因克隆的方法构建Pc p55抗原基因部分片段真核表达载体,并在COS-7细胞中进行表达,为进一步开展核酸疫苗免疫特性研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物模型、菌株、细胞及载体 雌性清洁级SD大鼠(南通大学实验动物中心),Esherichia coliDH5α菌株(上海生工生物工程有限公司);COS-7细胞株(本室保存);pGEM-T载体(Promega公司);pcDNA3.1(+)(本室保存)。

1.1.2 主要试剂 基因组DNA纯化试剂盒、柱式DNA胶回收试剂盒、柱式质粒小量/中量抽提试剂盒(上海生工生物工程公司);XHoI、EcoRⅠ、T4连接酶、耐热TaqDNA聚合酶(TAKARA公司);Lipotap转染试剂盒(碧云天生物技术研究所);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司);其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立 参考文献〔6〕方法,建立大鼠源肺孢子菌肺炎动物模型。

1.2.2 基因组DNA的提取 按文献〔7〕方法,提取大鼠源肺孢子菌基因组DNA。

1.2.3 引物设计及PCR扩增 根据已报道p55基因序列〔8〕设计一对引物,用Primer5.0分析软件分析其可行性。引物序列:上游引物(P1):5＇CCGGAAT TCACCATGGATT TATGTTGT 3＇下游引物 (P2):5＇CCGCTCGAGTCAATGCGTATTATCTG 3＇,上海英骏生物工程技术服务有限公司合成。PCR 体系:模板 2μ g,上下游引物(20μ mol/L)各 1μ L,TaqDNA 聚合酶 0.5μ L,dNTP 4μ L,PCR Buffer 5μ L,MgCl25μ L,加 ddH2O 至 50μ L 。反应按下列条件进行:94℃3min,94℃45s,60℃45s,72℃60s,反应 30个循环,最后72℃延伸7 min,电泳检测扩增产物。

1.2.4 pGEM-582基因克隆与鉴定 PCR产物经凝胶电泳后,回收目的条带,与pGEM-T载体连接,转化DH5α感受态细胞,筛选白色菌落过夜培养,质粒抽提,酶切鉴定。

1.2.5 重组表达质粒pcDNA3.1(+)-582的构建取适量pGEM-582基因和pcDNA3.1(+)质粒,分别用EcoRⅠ和X HoⅠ双酶切。再进行连接反应:10×T4 DNA连接酶 buffer 1μ L,T4 DNA连接酶(20U/μ L)1μ L,双酶切的 pcDNA3.1(+)1μ L,双酶切的基因片段5μ L,共10μ L体系;并以水代替目的基因片段作为对照。连接产物转化DH5α,筛选,小量扩增后,抽提重组表达质粒 pcDNA3.1(+)-582。

1.2.6 重组表达质粒pcDNA3.1(+)-582的鉴定用EcoRⅠ和X HoⅠ双酶切重组表达质粒pcDNA3.1(+)-582,进行琼脂糖凝胶电泳初步鉴定并测序。

1.2.7 重组表达质粒 pcDNA3.1(+)-582转染COS-7细胞 COS-7细胞常规培养传代,至细胞60%～70%融合,采用脂质体转染法,分别将pcDNA3.1(+)-582质粒和pcDNA3.1(+)空质粒转染COS-7细胞。

1.2.8 RT-PCR法检测mRNA表达 参照Trizol试剂盒说明书进行操作,常规抽提转染pcDNA3.1(+)-582质粒和pcDNA3.1(+)空质粒的COS-7细胞中的总 RNA,分别取上述总RNA 2μ g,逆转录合成cDNA第一条链,再进行PCR扩增,反应条件同1.2.3。分别取少量PCR产物进行电泳检测,判断PCR产物大小。

1.2.9 SDS-PAGE检测蛋白表达 用细胞裂解液裂解细胞,收集转染重组质粒、空质粒的COS-7细胞培养液,经离心后提取上清,与加样缓冲液混合,分别用沸水煮5 min,各取20μ L电泳,同时用细胞培养液作阴性对照。电泳结束,考马斯亮蓝染色,脱色液脱色后凝胶摄像。

2 结 果

2.1 大鼠源肺孢子菌p55基因片段PCR扩增结果应用PCR扩增大鼠源肺孢子菌p55基因得到约582 bp的条带,与实验预期结果相符(图1)。

图1 PCR扩增结果Fig.1 Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresis

2.2 重组表达质粒pcDNA3.1(+)-582的筛选、酶切及测序 从含X-gal的培养基中选择白色菌落,抽提的质粒酶切电泳显示两条带,一条为插入p55基因片段约582 bp,另一条为切开的载体质粒pcDNA3.1(+)约5.4 kb的片段(图2)。测序结果与先前报道〔8〕一致。

图2 重组质粒双酶切及PCR鉴定结果Fig.2 Characterization of the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-582by restrictionenzymedigestionand PCR products

2.3 RT-PCR法检测结果 将转染pcDNA3.1(+)-582质粒的COS-7细胞进行RT-PCR,扩增出pcDNA3.1(+)-582特异性基因片段,产物大小与预期片段大小相符(图3)。

图3 RT-PCR结果Fig.3 RT-PCR analysis of pcDNA3.1(+)-582 expression

2.4 SDS-PAGE结果 将转染pcDNA3.1(+)-582质粒的COS-7细胞裂解液进行SDS-PAGE,在分子量约21 kDa左右的区域出现一特异蛋白条带(图4第1道),这与 p55片段蛋白大小一致,其空质粒的细胞裂解液及未转染细胞裂解液中无此条带(图4中第2、3道)。

图4 SDS-PAGE检测蛋白表达Fig.4 SDS-PAGE analysis of the protein expression of pcDNA3.1(+)-582

3 讨 论

大鼠源肺孢子菌55kDa蛋白(p55)是菌体的主要抗原分子之一,目前,有关p55的生物学功能并不完全清楚。Smulian等〔4〕发现天然 p55蛋白能刺激宿主产生细胞免疫和体液免疫反应,重组p55蛋白主动免疫能够产生部分免疫保护作用,因此p55抗原在宿主的免疫防御上起着重要的作用。Zheng等研究发现p55作为非CD4+T细胞依赖的疫苗能防止小鼠感染 Pc,认为是最有希望的候选疫苗〔9〕。Ma等研究认为p55抗原重复序列至少存在一个抗原表位〔10〕。p55抗原分子能引发宿主产生较强的细胞免疫应答及体液免疫应答〔8〕。其原因是p55在主动免疫后,其 5＇端 p55(1-200)具有免疫原性,进而引起细胞免疫及体液免疫〔5〕。

由脂质体介导的转染是将DNA导入细胞且重复性较好的方法之一。其原理是带阳性电荷的脂质体与带阴性电荷的DNA之间可以有效地形成复合物,此复合物通过内吞作用可进入细胞中。存在于细胞质中的DNA-脂质体复合物仍然保持着完好的结构,并有机会以同样的方式与细胞核膜发生相互作用,并进入核内,从而启动外源基因转录表达。利用这种方法将重组质粒转染COS-7细胞后,将培养48 h的细胞收集起来用PBS缓冲液清洗3次后,一部分提取细胞总RNA,用克隆片段的上下游引物进行特异性RT-PCR扩增,结果转染了重组质粒的COS-7细胞RT-PCR产物阳性,而对照组结果阴性,表明确实有p55基因片段的RNA转录体产生,即表明p55基因的片段能够表达;一部分进行SDSPAGE分析,结果显示细胞裂解液中有p55基因片段蛋白的产生,而空质粒的细胞裂解液及细胞培养液中无相应蛋白产生。

真核表达的质粒DNA可在多种组织细胞表达外源蛋白质。本研究所用细胞系为COS细胞系,COS细胞系是进行外源性DNA真核表达最常用的宿主细胞之一,对SV40系列载体转染具较高敏感性。在常规转染实验中,每个COS细胞可积聚大于105个带SV40复制起点的重组表达质粒,且能高效表达重组表达质粒所携带的外源DNA片段。所采用的真核表达载体pcDNA3.1(+)含有一定数量的CpG寡核苷酸序列。这种在原核生物基因组中以一定频率存在的未甲基化CpG二核苷酸,能够在动物体内通过一系列连锁反应,而激活机体的免疫系统,放大抗原的免疫效应,而具有免疫佐剂的功能。导入个体的疫苗DNA被B细胞、巨噬细胞等抗原提呈细胞内吞后,质粒中的CpG寡核苷酸序列可被宿主细胞识别,并激活核因子NF-κ B(NFkappaB),从而诱导IL-6、IL-12和干扰素等细胞因子分泌,进而产生一定的免疫应答。

本研究成功构建重组表达质粒 pcDNA3.1(+)-582。采用了脂质体包裹瞬时转染细胞的方法转染COS-7细胞,结果表明pcDNA3.1(+)-582重组质粒能成功转染体外培养的 COS-7细胞并在mRNA水平及蛋白水平上均检测到有效表达。为进一步深入进行大鼠源肺孢子菌p55抗原基因片段核酸疫苗的免疫特性研究奠定了基础。

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Construction and expression of the eukaryotic expression vector containing the p55 gene fragment of ratPneumocystis

YI Liang-heng,QIN Yong-wei,CHEN Jin-ling,ZHU Dan-dan,HE Xing-xin,DUAN Yi-nong

(Department of Parasitology,School of Medicine,Nantong University,Nantong226001,China)

To construct the eukaryotic expression plasmid containing the p55 gene fragment ofPneumocystisand to investigate the efficient expression in COS-7 cells,the gene fragment conaining the whole length of p55 gene was used as template to amplify this fragment with PCR and the amplified fragment was then cloned to vector pGEM-T.After enzyme digestion,p55 gene was cloned to the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)to construct the plasmid pcDNA3.1(+)-582.This plasmid was then transfected to the eukaryotic expression cells COS-7 and PCR and SDS-PAGE assays were used to confirm the presence of target protein in these cells.In these ways,the eukaryotic expression vector for the p55 gene ofPneumocystisof rats was successfully constructed and expressed in COS-7 cells,thus providing the basis for further studies on the nucleic acid vaccine.

Pneumocystisof rats;p55 gene fragment;eukaryotic expression

R382.9

A

1002-2694(2010)01-0025-04

*南通大学自然科学基金资助项目(No.08Z044)

段义农,Email:ynduan@126.com

1.南通大学医学院寄生虫学教研室,南通 226001;

2009-07-13;

2009-10-11