SBHL对甲状腺鳞癌细胞株SW579生长抑制作用的研究

崔焕波,艾金霞

(1.吉林省公安边防总队医院,吉林长春 130051;2.北华大学医学院 免疫教研室)

SBHL对甲状腺鳞癌细胞株SW579生长抑制作用的研究

崔焕波1,艾金霞2

(1.吉林省公安边防总队医院,吉林长春 130051;2.北华大学医学院 免疫教研室)

目的观察SBHL对甲状腺鳞癌SW579细胞生长的抑制作用,从分子水平探讨SBHL对甲状腺鳞癌SW579细胞生长抑制作用的机制。方法用MTT比色法观察不同浓度和作用时间的SBHL对甲状腺鳞癌SW579细胞增殖的影响;用流式细胞术对细胞周期进行分析;TRAP-银染法检测端粒酶活性。结果5×10-5mol/L-1×10-3mol/LSBHL对甲状腺鳞癌SW579细胞增殖有明显的抑制作用,这种抑制作用随SBHL浓度的增加而增加;流式细胞术对细胞周期进行分析的结果显示,随着SBHL浓度的增加,S期细胞含量逐渐降低,G1期细胞含量逐渐增加,SBHL将细胞阻滞于G1期,抑制DNA合成。SBHL处理的甲状腺鳞癌SW579细胞与对照组相比,端粒酶活性明显降低。结论(1)SBHL对甲状腺鳞癌SW579细胞生长具有明显的抑制作用,而且这种抑制作用与SBHL的浓度呈正相关。(2)其机制可能与下调端粒酶活性,进而抑制肿瘤细胞生长有关。

澳洲茄胺盐酸盐(SBHL);甲状腺鳞癌;端粒酶

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0982)

SBHL(带码)即澳洲茄胺盐酸盐为中药一类新药,分子量为450.10,样品纯度大于99.2%。SBHL是从龙葵浓缩果汁中提取出的一种单体成分。国内外有对龙葵的成分、分离方法、抗凝血作用、抗肿瘤及对血糖作用的研究[1]。目前研究表明,SBHL对人体肝癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、HeLa细胞均有明显的抑制作用;实验表明澳洲茄胺盐酸盐通过增强免疫力,抑制核糖核酸的合成、代谢,诱导细胞分化作用[2,3]。SBHL能显著下调HeLa细胞 c-myc基因、对正常细胞生长影响较小[4]。但其对甲状腺鳞癌SW579细胞生长抑制作用及抗肿瘤作用机制尚未见研究报道。

1 材料与方法

1.1 材料 甲状腺鳞癌SW579细胞购自吉林省肿瘤研究所;RPMI1640培养基(GIBCO公司);新生胎牛血清(北京鼎国生物公司);MTT(华美公司Sigma分装);DMSO(Sigma公司);CO2孵箱(日本平泽制作所);流式细胞仪(Beckman Coulter Epics XL);酶标仪(南京华标仪器厂);SBHL由北华大学医学院刘良教授提供 。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色试验 将甲状腺鳞癌细胞株SW579单细胞浓度调整到1×105/ml,接种于96孔培养板内,每孔 200 μ l;37℃,5%CO2。甲状腺鳞癌细胞株SW579分为对照组和实验组。实验组加入不同浓度的SBHL,使其终浓度分别为1×10-5mol/L、5×10-5mol/L、1×10-4mol/L、5×10-4mol/L、1×10-3mol/L,各组细胞均在培养24 h后加药,阴性对照组加入培养液;阳性对照组加入25 μ g/ml的 5-FU培养液;空白组为不加细胞培养液作本底对照调零,各设复孔3个 ;培养细胞 24、48、72、96小时分别取一块板,吸弃培养液,加入 5 mg/ml的MTT,20 μ l/孔。继续孵育4 hrs后,吸出各孔上清,加入二甲亚砜(DMSO),150 μ l/孔;用酶标仪于490 nm波长处测定各孔吸光度值(A值)并计算抑制率。细胞增殖抑制率=(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%

1.2.2 流式细胞术 取对数生长期的细胞接种于12孔培养板内,每孔1 ml。实验组分别加入含有不同浓度药物(1×10-5mol/L、5×10-5mol/L、1×10-4mol/L、5×10-4mol/L、1 ×10-3mol/L)每孔 50 μ l;对照组加入生理盐水;各设复孔3个;药物作用后72 hrs后,各孔细胞用0.25%的胰酶消化,收集在离心管离心(1 000 rpm/min)5min。PBS液漂洗2次。加入70%的冷乙醇固定,4℃冰箱保存过夜;弃乙醇,以PBS液漂洗;100目筛网过滤;离心后加入PI工作液0.5 mL,室温避光30 min,上机检测;使用Cell FIT软件分析结果。

1.2.3 TRAP-银染法检测端粒酶活性 培养细胞及加药处理同形态学观察。分别在48、72小时后用适量胰酶消化离心收集细胞。每组收集细胞5×106个细胞用于PCR实验;取 15 μ l PCR产物,与适量上样缓冲液充分混合后,加入上样孔中;接好电极,电压为80 V,电泳2 h左右,根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳;PAGE胶银染后用双蒸水清洗几分钟,照像。

2 结果

2.1 MTT比色试验 用MTT比色法测定不同浓度SBHL对SW579细胞增殖的影响见表1。

2.2 流式细胞仪分析结果 见表2、3。

2.3 端粒酶活性检测结果 端粒酶活性检测结果(图1)可以清楚的看到,对照组的电泳结果中可以比较清楚的看到15-16条条带,故可判断端粒酶活性为阳性,经RNA酶处理过的阴性对照组没有可见条带。从各药物处理组的 PCR产物电泳结果可以看到,1×10-5mol/L组能够观察到8-9条亮度较低的条带外,1×10-4mol/L组所看到的条带很少且颜色浅。1×10-3mol/L组几乎都不能观察到条带。

表1 SBHL对SW579细胞增殖抑制率的影响

表2 不同浓度的药物处理对SW579细胞周期的影响(±s n=3)

表2 不同浓度的药物处理对SW579细胞周期的影响(±s n=3)

与对照组(药物浓度0 mol/L)相比:＊P＜0.05▼P＜0.01

药物浓度(mol/L)细胞周期G1 S G2 0 56.7±2.57 21.2±3.63 22.1±3.06 1×10-5 60.2±1.58▼ 20.9±3.62 21.7±2.49 5×10-5 64.2±1.32▼ 20.2±3.30 20.5±2.51 1×10-4 64.6±2.32▼ 16.7±3.67▼ 19.9±2.11 5×10-4 66.7±2.48▼ 14.7±3.32▼ 19.6±2.03 1×10-3 78.1±2.91▼ 10.5±2.84▼ 11.5±3.01▼

表3 不同浓度的药物处理对SW579细胞凋亡率的影响(±s n=3)

表3 不同浓度的药物处理对SW579细胞凋亡率的影响(±s n=3)

与对照组(药物浓度0 mol/L)相比:＊P＜0.05▼P＜0.01

药物浓度(mol/L) 凋亡率(%)0 1.9±1.3 1×10-5 5.4±2.42▼5×10-5 6.8±2.65▼1×10-4 21.8±2.53▼5×10-4 24.7±1.45▼1×10-3 28.9±1.90▼

图1 不同浓度药物对SW579细胞端粒酶活性的影响(±s,n=3)

3 讨论

本实验不同浓度SBHL与人甲状腺鳞癌SW579细胞共同孵育24 h、48 h、72 h、96 h四个时间段后测其A值并计算细胞生长抑制率,结果在1×10-5mol/L-1×10-3mol/L的浓度范围内细胞增殖受到不同程度抑制,细胞生长抑制率与药物浓度和药物作用时间呈依赖关系。

从周期变化来看,SBHL作用72小时后可使甲状腺鳞癌SW579细胞受阻于GI期,导致 S期细胞降低。因为肿瘤细胞增殖的快慢,主要取决于细胞G0/GI期的长短,G0/GI期短,肿瘤细胞增殖快,处于G0/GI期的细胞数少,故GI期阻滞可使细胞生长周期延长,细胞的恶性增殖减慢,同样说明了SBHL对甲状腺鳞癌SW579细胞的抑制作用。

应用流式细胞仪PI染色法对SBHL作用72小时后的甲状腺鳞癌SW579细胞DNA含量进行检测。结果显示,SW579细胞经1×10-5mol/L-1×10-3mol/L浓度的SBHL作用后都发现了位于G I期前的亚G I锋,且凋亡率呈浓度依赖性。

本实验从实验结果来看,可明显的看到对照组的电泳条带多,且清晰,随着药物浓度的升高,条带也越来越少且不清晰,当药物浓度为1×10-3mol/L时,已几乎看不到条带。提示随着药物作用浓度的增加,端粒酶的活性有明显的降低,说明甲状腺鳞癌细胞的恶性程度减低,SBHL具有抗肿瘤作用。

[1]谢启梅,谢军荣.龙葵在肿瘤治疗中的应用[J].江西中医药,1996,27(2):52.

[2]艾金霞,刘 良.SBHL对HeLa细胞生长抑制作用的影响[J].第四军医大学学报,2004,25:1791.

[3]艾金霞,刘 良.SBHL对小鼠免疫功能影响的实验研究[J].中国免疫学杂志,2007,8:1791.

[4]艾金霞,刘 良.SBHL对人宫颈癌细胞凋亡作用的实验研究[J].北华大学学报,2008,1:221.

Study of the inhibition of SBHL on growth of thyroid gland cancer SW579 cells

CUI Huan-bo,AI Jin-xia.(Jilin Province Public Security BorderDefense Corps Hospital,Laboratory Medicine,Changchun130051,China)

ObjectiveTo observe the inhibiting effects of Sdosodine Hydrochlorida on the growth of thyroid gland cancer SW579 cells and investigate the inhibiting mechanisms from molecular levels.MethodsThe proliferation of thyroidgland cancer SW579 cells were observed by MTT assay.The changes of the cell cycle of Hela cell treated with Sdosodine Hydrochlorida were analyzed by FlowCytometry.The tolermerase activity were detected by TRAP-silver staining.ResultsThe proliferation of thyroid gland cancer SW579 cells were inhibited at 1×10-5mol/L-1×10-3mol/L Sdosodine Hydrochlorida.The inhibiting effect increased gradually following the increase of concentration of Sdosodine Hydrochlorida.The percentage of thyroid gland cancer SW579 cells in S phase decreased and the percentage of cells in G1 phase increased after treated by Sdosodine Hydrochloridia,indicating Sdosodine Hydrochlorida arrested thyroid gland cancer SW579 cells in G1 phase and thus the systhesis of DNA was inhibited.After treated by Sdosodine Hydrochlorida,the expressions of telomerase of thyroid gland cancer SW579 cells were downregulated obviously.Conclusion(1)The growth of thyroid gland cancer SW579 cells were inhibited obviously by Sdosodine Hydrochlorida and the inhibiting effect was dependent on concentration of Sdosodine Hydrochlorida;(2)The tolermerase activity were downregulated,the growth of thyroid gland cancer SW579 cells were inhibited by Sdosodine Hydrochlorida.

Sdosodine Hydrochloridia;thyroid gland cancer SW579 cells,telomerase

R733.705

A

1007-4287(2010)07-0982-03

吉林市卓怡康纳中药研发基金(ZY040301)

*通讯作者

2009-03-09)