骨髓间充质干细胞移植对视神经损伤大鼠视网膜细胞凋亡的影响

吴 艺,郭小东,刘 洁

(1.广东省第二人民医院眼科,广东广州 510317;2.中国医科大学实验技术中心)

骨髓间充质干细胞移植对视神经损伤大鼠视网膜细胞凋亡的影响

吴 艺1,郭小东1,刘 洁2

(1.广东省第二人民医院眼科,广东广州 510317;2.中国医科大学实验技术中心)

目的研究骨髓间充质干细胞移植对视神经损伤大鼠视网膜细胞凋亡的作用。方法制作大鼠视神经钳夹伤模型,随机分为干细胞移植治疗组(M组)和磷酸缓冲液治疗对照组(P组),取大鼠股骨和胫骨骨髓,密度梯度离心结合贴壁筛选法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)并鉴定,将传代培养后的定量MSCs注入损伤术后M组大鼠双眼玻璃体内,P组大鼠则注入等体积PBS,观察视神经损伤后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d和 28 d视网膜形态学改变并应用流式细胞仪检测视网膜细胞凋亡率变化。结果视神经损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,R GCs)数目随时间延长而减少,组内前后时间段比较有显著性差异(P＜0.05);M组RGCs降低速度明显慢于P组,M组各时间段RGCs数目与P组同时间段相比均增高,有显著性差异(P＜0.05);视神经损伤后视网膜细胞出现凋亡,1 d-14 d内随时间延长凋亡率不断上升,14 d达到高峰,随后下降;损伤后21 d内M组各时间段细胞凋亡率均低于P组,二者比较有显著性差异(P＜0.05),损伤后28 d二者的细胞凋亡率没有统计学差异(P＞0.05)。结论MSCs玻璃体内移植可提高视神经损伤大鼠RGCs的存活率,抵抗视网膜细胞凋亡。

视 神经 损伤;骨 髓间充 质干 细胞;视 网膜 神经节 细胞 ;细胞 凋亡

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0987)

骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植对中枢神经系统损伤的治疗作用在不同实验研究中得到证实[1,2],也有研究将自体MSCs移植到玻璃体内或视网膜下腔,发现移植的MSCs能与宿主视网膜整合,并分化表达视网膜感光细胞特异性抗原[3,4]。但其在视神经损伤治疗中的研究尚未见报道,本实验将体外培养后的定量MSCs注入视神经损伤大鼠双眼玻璃体内,观察在不同时间段RGCs的变化及视网膜细胞凋亡情况,以探讨MSCs移植对视神经损伤的修复作用和机制。

1 材料和方法

1.1 材料

L-DMEM(GIBCO/BRI)、胎牛血清(Hyclone公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司)、兔抗大鼠CD44、CD45多克隆抗体、山羊抗兔SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均购自博士德公司;碘化丙啶(PI)购于上海华美生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养 出生8-14 d的健康SD大鼠,体重15-20 g,雌雄不限,由中国医科大学实验动物部提供。实验无菌条件下取SD大鼠胫骨和股骨,切除干骺端,用含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 mg/ml链霉素的L-DMEM培养液冲洗骨髓腔,收集冲洗液反复吹打制成单细胞悬液。取一无菌离心管,加入和骨髓悬液等体积的大鼠淋巴细胞分离液,室温静止15 min,将细胞悬液缓慢滴加到淋巴细胞分离液上层,4℃,2 000 rpm离心25 min,吸取单核细胞密度界面层细胞,加无血清培养液稀释至5 ml,1 000 rpm离心5 min洗涤2次,以含20%胎牛血清的DMEM完全培养液重悬沉淀后计数细胞按2×106/ml密度接种于25cm2塑料培养瓶,放入37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内常规培养。第 3 d半量换液,除掉不贴壁的血细胞和造血干细胞,以后每3d换液一次,在倒置显微镜下观察,待10-14 d细胞接近80-90%汇和时,0.125%胰蛋白酶消化,传代培养。

1.2.2 MSCs鉴定 胰酶消化传代的MSCs制成1×104/ml单细胞悬液,接种于预先放置多聚赖氨酸包被盖玻片的6孔培养板内,常规培养48 h,弃去培养液,0.1 M冷PBS冲洗,冷丙酮固定15 min,3%过氧化氢封闭10 min灭活内源性过氧化物酶,正常山羊血清封闭20 min,加1∶100稀释的一抗(兔抗大鼠CD44、CD45)37℃孵育1 h,滴加生物素化山羊抗兔二抗 37℃孵育30 min,滴加SABC试剂37℃孵育20 min,DAB显色,苏木素轻度复染、脱水、透明、封片,显微镜下观察拍照,同时用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 模型制作及分组 成年SD大鼠66只,体量250-350 g,由中国医科大学实验动物部提供,外眼及眼底检查均正常。60只按随机数字表法分为干细胞移植治疗组(M组)和磷酸缓冲液治疗对照(P组),每组30只,参照文献建立视神经部分损伤模型:40 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉后,充分暴露视神经,用反向镊于球后2 mm处夹持双侧视神经30 s,夹持后无持续缺血,段时间血流恢复良好者证明模型成功,操作中避免损伤血管。M组在损伤术后立即向双眼玻璃体内注入定量MSCs,P组则注入等体积0.1MPBS,分别于治疗后 1 d、3 d 、7 d、14 d 、21 d、28 d处死大鼠(每个时间段5只)。另取6只大鼠假手术组作为对照,在同一时间点取一只处死,标本的处理同治疗组。

1.2.4 细胞移植 取3代MSCs细胞,胰酶消化,用0.1MPBS制成 2×104个/μ l细胞悬液,置于冰上。40 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉大鼠,M组用微玻管从眼球巩膜角膜缘处缓慢注入1.5 μ l MSCs悬液,P组则注射等量 PBS,分别于移植实验后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d处死动物,摘除眼球,HE染色后光镜下观察视网膜形态学变化、显微图像分析计数神经节细胞,流式细胞仪测定视网膜细胞凋亡率。

1.2.5 视网膜形态学观察和RGCs计数 新鲜眼球,常规酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,纵向视网膜全层切片,厚5 μ m,HE染色,中性树脂封片,光镜下观察。每只眼球以视网膜中心层切片为基准,再从其前后相邻部位各取一张切片,共计3张切片,每张任意选取5个高倍视野(×40),采用图像分析系统测量RGCs数。

1.2.6 细胞凋亡率检测 在垫有冰块的玻璃平皿中小心去除角膜和晶状体,剥离下视网膜,D-Hanks液漂洗2次,置于 4℃预冷的生理盐水中备用。剪碎研磨视网膜,加入0.25%胰蛋白酶和0.5%胶原酶(1∶1)37℃振荡消化10 min,移液管吹打,镜下观察直至分散成单个细胞,用10%胎牛血清终止反应。4℃1 000 rpm离心5 min,弃上清,PBS洗涤后离心收集细胞,70%冰预冷乙醇4℃固定24 h,离心弃去固定液,PBS洗涤后重悬沉淀,加入 50 μ g/ml RNase 37℃反应1 h,400目筛网过滤,1 000 rpm离心5 min,弃去 PBS,100 μ g/ml PI 4℃避光染色 30 min。

2 结果

2.1 MSCs纯化和鉴定

经分离纯化的细胞体外培养48 h后,多数呈球形、椭圆形贴壁生长;72 h后大多数细胞呈梭形并带有多个突起,细胞核较大,扁圆形,可见1-2个核仁;培养10-12 d,细胞形态较为均一,胞体细长呈梭形;反复换液和传代培养去除非贴壁细胞,至第3代时细胞呈梭形或扁平形,倒置相差显微镜下观察细胞融合呈漩涡状排列。CD44、CD45免疫细胞化学染色呈阳性反应,表现为胞质内可见棕黄色颗粒,阴性对照组胞质不着色。

2.2 视网膜形态学改变

正常对照组视网膜由内向外分为神经节细胞层、内核层和外核层,各层平行致密排列;视神经损伤后1 d、3 d仅见视网膜毛细血管不同程度扩张,少数破裂出血,各治疗组同正常对照组相比无明显改变;伤后7 d,P组可见神经节细胞层胞核散乱分布,体积缩小,核染色质边聚浓集,内核层及外核层变薄,细胞排列紊乱,M组视网膜结构无明显变化;14 d,P组胞核数目明显减少,稀疏排列,浓缩核多见,内核层及外核层明显变薄,M组大而浅染的神经节细胞核减少,染色质浓集明显;21 d,28 d,P组和M组各层细胞数目明显减少,神经节细胞层胞核稀少,染色质浓集,空化节细胞及胶质细胞浸润,内、外核层细胞减少,M组损伤程度相对较轻。

2.3 RGCs计数

视神经损伤后1 d,M组和P组 RGCs稍有下降,与正常对照组相比差异不显著(P＞0.05);3 d时M组和P组细胞数目开始明显减少,7 d之前细胞数目迅速下降,14 d后速度减慢,21 d后细胞数目无明显减少,M组各时间点RGCs数均高于P组,差异具有统计学意义(P＜0.05),但均低于对照组;对照组RGCs数量在各时间点没有明显变化。各时间点具体的数目改变见表1。

表1 视神经损伤不同时间组RGCs数目改变

2.4 细胞凋亡率

对照组没有检测到典型的细胞凋亡峰,损伤后1 d、3 d、7 d和14 d细胞凋亡率逐渐增多,至第14 d达高峰,21 d细胞凋亡率下降,28 d持续减少。在损伤28 d时M组和P组细胞凋亡率差异不显著(P＞0.05),其余各时间点M组细胞凋亡率均低于P组,二者比较差异均有统计学意义(P＜0.05),各时间点具体细胞凋亡率改变见表2。

表2 视神经损伤不同时间组细胞凋亡率改变

3 讨论

由于视神经损伤晚期,RGCs已大部分或全部发生凋亡,残留细胞数目非常有限,即使这些细胞的轴突完全再生,也不足恢复有效的神经功能,无法达到治疗目的。随着分子生物学和组织工程学技术的飞速发展,转基因治疗联合干细胞移植技术将为临床处理本病提供新的治疗思路。神经干细胞虽然是较为理想的有效移植物,但由于其来源仅限于胚胎干细胞诱导分化或从胎脑、胎眼中直接分离,很难获得足够的神经细胞移植物满足临床需求[5];虽然可利用自体细胞体外培养扩增后再移植,但由于中枢神经细胞位置深在,获取细胞必然对组织造成损伤,因此寻找一种新的移植细胞来源对于基础研究与临床应用都至关重要。

MSCs是目前干细胞研究中最受关注的一种细胞,其优点为:①抗原性弱,无免疫排斥;②标本来源广泛(骨髓穿刺、脐血与外周血),容易获得;③分离培养增殖速度快,能大量扩增;④具有多种分化潜能,易于外源基因的转染和表达;⑤无任何道德或法律问题[6]。MSCs移植对神经系统损伤的治疗作用在不同实验研究中得到证实,实验研究发现中枢神经系统MSCs移植后遍及全脑,并分化成为神经细胞,呈现中枢神经系统神经元的特征[7]。其作用机制可能是多方面:移植的MSCs向病变部位组织渗透融合、替代损伤细胞、重建神经环路,从而达到恢复神经功能的目的;一些移植的MSCs在新环境诱导下可以表达神经细胞表型;MSCs同宿主神经组织间的相互作用还可导致一些细胞因子的产生,这些细胞因子对神经功能的恢复发挥积极的作用[8]。

在本研究中我们将定量MSCs注入视神经损伤术后大鼠双眼玻璃体内,观察不同时间点视网膜形态,RGCs数目及视网膜细胞凋亡率改变,结果显示损伤3 d时M组和P组细胞数目开始明显减少,7 d之前细胞数目迅速下降,14 d后速度减慢,21 d后细胞数目无明显减少,MSCs治疗后RGCs数目增加;损伤后1d、3d、7d和14d细胞凋亡率逐渐增多,至第14 d达高峰,21d细胞凋亡率下降,28d持续减少。在损伤28d时M组和P组细胞凋亡率差异不显著,其余各时间点M组细胞凋亡率均低于P组,二者比较差异均有统计学意义。由于可见MSCs玻璃体内移植可以有效缓解视神经损伤后RGCs破坏,抑制其凋亡,提高细胞存活率,从而为MSCs对受损节细胞的保护作用提供了实验基础,MSCs及转基因MSCs移植将可能成为视神经损伤治疗的新策略。目前关于RGCs凋亡的具体机制尚不十分明确,有待进一步深入研究探讨。

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The influence of mesenchymal stem cell transplantation on the cell apoptosis after optical nerve injury in rats

WUYi,Guo Xiao-dong,LIU Jie.(Ophthalmology,Department of the Second Hospital of Guangdong Province,Guangzhou510317,China)

ObjectiveTo investigate the effect of mesenchymal stem cell(MSCs)transplantation on retinal ganglion cells(RGCs)of Sprague-Dawley(SD)rats with optic nerve injury.MethodsOptic nerve crush injury modelswere induced in the eyes of sixty-six adult SD rats by a calibratedmethod,whichwere randomly divided into group M(MSCs)andgroupP(PBS).MSCswere isolated from SD rats by gradient centrifugation and anchoring culture method.Immunocytochemical staining was used to explore the surface antigen marker.The morphological changes of optic nerves were observed andthe number of R GCs were examined by HE staining at 1 d、3 d 、7 d、14 d、21 d and 28 d after optic nerve injury.At the same time,cell apoptosis rate of retinal was measured by flow cytometery.ResultsThe number of RGCs was reduced significantly after optical nerve injury.The speed of R GCs decline in M group was more slowly than that of the P group,the number of R GCs inM groupwere higher compared with the P group at the same injury period,there was statistical significance between them(P＜0.05).The rate of cell apoptosis increased and reached peak at 14d after optical nerve injury and then decreased.The apoptotic rate of M groupwere lower than that of P group at 1 d、3 d、7 d、14 d、21 d,there was statistical significance between them(P＜0.05).At 28 d after injury,there was no statistical significance betweenM group and P group(P＞0.05).ConclusionMSCs transplantation could rescue the survival rate of injured RGCs in optic nerve-crush rat and resist the cell apoptosis of retinal to realize it's protective effect.

optical nerve injury;mesenchymal stem cell;retinal ganglion cells;apoptosis

R329.2+8 R774.1

A

1007-4287(2010)07-0987-03

广东省医学基金资助项目(A2008137)

2009-06-12)