不同低氧训练模式对大鼠脑组织线粒体呼吸链酶复合体活性的影响

李洁 彭丽娜 余小燕 陈莉

1西北师范大学体育学院（兰州 730070） 2廊坊师范学院3青海省体育科学研究所 4甘肃省兰州市第八十二中学

低氧训练是利用“缺氧”刺激使机体各系统产生抗缺氧的生理性适应，从而提高机体运输和利用氧的能力，最终达到提高有氧代谢能力的目的［1］。低氧环境对机体的影响是多方面的。不同低氧训练模式对血液运氧能力、组织毛细血管密度及有氧代谢酶活性的影响已见报道［2-5］。但有关不同低氧训练模式对组织线粒体呼吸链功能影响的研究少见报道。脑作为神经系统的中枢，在机体正常生理活动过程中发挥着极为重要的调节作用。另外，脑组织几乎不能进行糖无氧代谢，因此其线粒体氧化磷酸化的功能在脑能量合成代谢中的作用尤为重要。鉴此，本研究通过比较四种低氧训练模式下大鼠脑组织线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ活性，探讨不同低氧训练模式对脑线粒体呼吸链功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验对象

雄性健康2月龄W istar大鼠50只（由兰州大学医学院实验动物中心提供），体重130g左右。分笼饲养，每笼5只。国家标准啮齿类动物饲料喂养，自由饮食饮水，室温23±2℃左右，相对湿度50±5%，自然采光。饲养室、用具等定期（每周一次）用紫外灯消毒灭菌。

1.2 低压氧舱

本实验所用的模拟低氧环境设备是自制的低压氧舱，采用降低环境大气压的办法形成低压低氧条件。主要用有机玻璃制成一封闭室（舱），安装通入室内的抽气阀和进气阀，再与真空泵连接，启动真空泵，不断抽出室内气体，造成低气压。操纵气阀，调节抽气量和进气量的比例，造成舱内模拟高原高度3500m的低气压低氧环境。舱内压力用标准海拔表校正［6］。

1.3 适应性训练及动物筛选

（1）环境适应：大鼠购入后在动物房饲养2天，使大鼠适应动物房环境。（2）跑台适应：所有大鼠在常氧（海拔1500m，大气压为632mmHg，氧浓度为 17.4%）条件下进行1次/天、共2天的水平跑台适应性训练，每次运动强度从12m/min开始递增到18m/min，运动时间15min。使大鼠熟悉跑台。（3）强度适应性训练：大鼠适应跑台后进行1次/天、共1周的强度适应性训练，运动强度从20m/min开始，每天递增 3m/min，最终达到 35m/min，运动时间15min。使大鼠逐渐适应正式耐力训练的强度。（4）低氧适应：分为居住性适应和运动性适应，首先，所有大鼠进行2天低氧舱内居住适应，模拟海拔高度从2500m增至3500m（大气压为493mmHg，氧浓度13.6%），每天适应2h。随后进行4天低氧递增负荷运动适应，模拟海拔高度3500m，跑台速度由20m/min递增到30m/min，训练时间由 30min递增到 60min。（5）动物筛选：根据体重、低氧适应和跑台运动适应情况，淘汰体重过重或过轻、低氧适应性较差和不适应跑台运动的大鼠，保留40只大鼠进行正式实验。

1.4 动物分组

筛选出的40只大鼠随机分为5组（n=8）：常氧训练组（living low-training low，LoLo）、高住高练组（living high-training high，HiHi）、高住低训组（living high-training low，HiLo）、低住高练组（living low-training high，LoHi）和高住高练低训组（living high-exercise high-training low，HiHiLo）。称量各组大鼠体重。LoLo组在常氧环境进行训练，训练时间以外均生活在常氧环境。非训练日24h生活在常氧环境。HiHi组在低氧（模拟海拔3500m高原，氧浓度为13.6%）环境进行训练，训练时间以外均生活在低氧环境中。非训练日24h生活在低氧环境。HiLo组在低氧环境生活12h/d，在常氧环境进行训练，训练后生活在常氧环境。非训练日12h生活在低氧环境，12h生活在常氧环境。LoHi组在低氧环境进行训练，训练时间以外均生活在常氧环境。非训练日24h生活在常氧环境。HiHiLo组低氧环境生活12h/d，常氧环境进行训练，另外，训练日隔天增加一次低氧环境训练，训练时间以外均生活在常氧环境。非训练日12h生活在低氧环境，12h生活在常氧环境。

1.5 训练安排

参见文献［7］。训练组大鼠采用水平动物跑台进行耐力训练，训练强度常氧下第1周25m/min，第 2～4周30m/min，第 5周 35m/min，低氧（氧浓度为13.6%）下第 1周 20m/min，第 2～4周 25m/min，第 5周 30m/min；持续运动时间第 1周 30min/d，第 2周 40min/d，第 3周50min/d，第4～5周60min/d；每周训练6天。跑台运动训练中均使用机械刺激，未使用电刺激。

1.6 取样及线粒体制备

各组大鼠最后一次训练结束，均在常氧环境恢复生活72h，称体重后，进行速度为35m/min水平跑台力竭运动。力竭标准为［8］：大鼠跟不上预定跑台速度，腹部与跑道面接触，后肢蹬地无力，臀部压在跑台后壁，后肢随转动皮带后拖达30s，毛刷刺激驱赶无效，视为力竭。力竭后即刻断头处死大鼠，迅速取出脑组织，置于冷生理盐水中洗净，滤纸吸干表面水分，置于液氮中冷冻，－20℃低温保存待用。脑组织匀浆液及线粒体制备参照文献［9］。

1.7 测试指标及方法

（1）线粒体呼吸链酶活性：参照Vyatlina的方法用分光光度法测定线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅲ活性［10］。将10～20μg线粒体蛋白加入到终体积为2m l的缓冲液中，以蒸馏水作空白管，校正光密度到0点，测定一定波长处3min光吸收值的变化。酶活性单位为μmol·mgpro-1·min-1。

（2）消光系数的测定：分别配制NADH（nicotinamide adenine dinuclectide-reduced，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）、DCPIP（2，6-dichlorophenolindophenol，2，6-二氯酚靛酚）和 cytochrome c（细胞色素C）的浓度梯度，在一定波长处，用10mm光径的比色杯比色，记录消光值，做出标准曲线，标准曲线的K值为各物质的消光系数。NADH 的消光系数 ε=5.022mM-1·cm-1，DCPIP 的消光 系 数 ε=16.625mM-1·cm-1，cytochrome c 的 消 光 系 数ε=7.038mM-1·cm-1。

（3）蛋白浓度测定：以牛血清白蛋白为标准，考马斯亮蓝法测定。

1.8 试剂与药品

2，3-dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1，4-benzoquinone（DB）、NADH、rotenone、cytochrome c、antimycin 为 Sigma 公 司产品，2，6-dichlorophenolindophenol（DCPIP）为 Fluka公司产品，其余为国产分析纯试剂。

1.9 主要仪器

YQ-3电动匀浆器（江苏金坛市仪表仪器厂）、UV 754N紫外分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司），DSPT-202型动物跑台（中国杭州段氏制作），UNIVERSAL 32R台式高速冷冻离心机（德国），低压氧舱（自制），海拔表（德国）。

1.10 统计学分析

实验数据均用算术平均数±标准差表示，组间比较采用SPSS13.0软件进行One-Way ANOVA单因素方差分析，P<0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 体重变化

正式实验前，与常氧训练组比较，4种不同低氧训练模式组大鼠体重均无显著性差异（P=0.524，P=0.058，P=0.740，P=0.136）。5周实验期结束后，5组大鼠体重较实验前均有所增加，与常氧训练组比较，各组均无显著性差异（P=0.198，P=0.840，P=0.219，P=0.707）。见表1。

表1 各组大鼠体重比较（n=8）

2.2 大鼠力竭运动时间

5周不同低氧模式训练后，与LoLo组相比，HiHi组、HiLo组和LoHi组大鼠力竭运动时间均无显著差异（P=0.078，P=0.595，P=0.294），HiHiLo 组力竭运动时间显著延长（P=0.040），延长19.85%。见表2。

表2 各组大鼠力竭运动时间比较（n=8）

2.3 脑组织线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ~Ⅲ活性

由表3可见，与LoLo组相比，其它各组大鼠脑组织线粒体呼吸链CⅠ活性均无显著变化；LoHi组CⅡ活性显著下降（P=0.016），降低76.199%，其余各组均无显著变化。HiHi组、HiLo组和LoHi组CⅢ活性均显著下降（P=0.001，P=0.002，P=0.000）， 分 别 降 低 71.496% 、65.240%和 87.838%；HiHiLo组显著上升（P=0.000），提高170.145%。

表3 各组大鼠脑组织线粒体呼吸链酶复合体活性比较（n=10） 活性单位：μmol·mgpro-1·min-1

3 讨论

有研究报道［11］，常氧运动组、髙住高练组、高住低训组和低住高练组大鼠实验前体重均无显著性差异，实验过程中，各组大鼠体重随着周龄的增加而增长，其中髙住高练组体重增长最慢，第4周末与常氧运动组大鼠相比具有显著性差异（P<0.05），其余各组体重增长的规律比较一致，且无显著性差异。本实验中，5周不同模式运动训练后，各组大鼠体重与训练前相比均有所增加。与常氧训练组相比，各组均无显著性差异。不同低氧训练模式下大鼠体重的变化同常氧训练模式一致，说明低氧复合运动与常氧复合运动对大鼠体重的影响无差异。以上髙住高练组研究结果的不一致可能与运动量和低氧程度不同有关。

本实验结果还显示，与常氧训练模式相比，大鼠跑台运动至力竭的时间，HiHi组、HiLo组、LoHi组均无显著性变化，HiHiLo组显著延长（P<0.05），延长 19.85%，表明HiHiLo模式更有利于延长大鼠运动至力竭的时间。

已有研究表明，大鼠递增负荷训练7周，力竭运动后即刻，与一次力竭运动对照组相比，脑组织线粒体呼吸链CⅠ、CⅡ和CⅢ活性均无显著性变化［9］。HiLo（高住低练）4周组大鼠心肌线粒体呼吸链CⅠ、CⅡ和CⅣ活性与常氧安静对照组相比显著升高（P<0.05或P<0.01），CⅢ活性无明显变化［12］。以上研究说明低氧训练可影响机体组织线粒体呼吸链酶活性。

本实验结果显示，与常氧训练组比较，HiHi组和HiLo组脑组织线粒体呼吸链CⅠ和CⅡ均无显著变化，CⅢ活性均显著性下降（P<0.01），分别下降71.496%和65.240%。LoHi组CⅠ活性无显著变化，CⅡ和CⅢ活性均显著下降（P<0.05，P<0.01），分别下降 76.199%和87.838%。由于CⅢ是电子传递链的限速步骤［13］，其活性降低必将影响呼吸链的功能，进而影响ATP的合成能力，因此，HiHi、HiLo和 LoHi在改善脑线粒体呼吸链功能方面与常氧训练比未见优势。HiHiLo组CⅠ和CⅡ均无显著变化，CⅢ活性均显著升高（P<0.01），提高170.145%，升高幅度较大。这提示HiHiLo模式较常氧训练具有显著提高脑线粒体电子传递链功能的效果。已有研究表明HiHiLo训练手段对血象指标和有氧运动能力的影响效果好于LoHi，尤其在赛前大负荷训练期间应采用 HiHiLo 模式［14］。

4 总结

就本研究建立的模拟海拔3500m高度的四种低氧训练模式来说，髙住高练低训比常氧训练具有显著提高线粒体电子传递链功能的效果，髙住高练、高住低训和低住高练在改善线粒体呼吸链功能方面与常氧训练比未见优势。

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