HPLC测定骨伤黄药散中姜黄素含量

李富贤 杨亮 米彩峰

（1.陕西省中医药研究院中药所 陕西西安 710001; 2.陕西省荣誉军人康复医院 陕西华阴 714200）

骨伤黄药散由姜黄,红花等五味中药组成,具有活血化淤,消肿止痛作用,用于治疗跌打损伤,骨折脱位的早期局部红肿青紫痛疼。属多年使用的医院制剂,疗效显著,广受患者欢迎。姜黄,为方中君药,姜黄素为姜黄主要有效成分,具有抗感染、抗炎、抗凝等作用,与本品功能主治一致;姜黄素的含量测定方法[1～5]有薄层扫描法、分光光度法、硼显色分光光度法,荧光分光光度法,高效液相色谱法。前4种方法采用在420nm波长测定黄色素的方法,测定结果不稳定,且受其他黄色素干扰,与其相比HPLC测定方法简单、灵敏、重现性好。故本研究建立以PR-HPLC法测定姜黄素含量来控制该制剂质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-2010A型高效液相色谱仪,UV-VIS紫外检测器,CLASS-VP色谱工作站;超声波清洗器(型号:KQ-100型昆山市超声波仪器有限公司)。

1.2 试药

姜黄素对照品(供含量测定用,批号110823-200603),购自中国药品生物制品检定所;样品由本研究所制备(批号090502,090504,090506);乙腈为色谱纯,水为纯净水,其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Akasil-C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-4%冰醋酸溶液(48:52)为流动相;流速:1.0mL.min-1;柱温:30℃;检测波长为430nm。

2.2 实验溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取本品细粉约0.3g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,称定重量,超声提取30min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,静置,微孔滤膜(0.45 μ m)滤过,作为供试品溶液。

图1 HPPLC图

表1 姜黄素回收率试验结果

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取已干燥至恒重的姜黄素对照品4.55mg置10mL量瓶中,加甲醇溶解,并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备溶液(0.455mg.mL-1)。精密量取该储备液0.7mL,置10mL的量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,配制成每1mL含0.0318mg的溶液,作为对照品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方比例称取除姜黄外的其它药材,按制备工艺制成缺姜黄阴性样品,并按2.2.1项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适应性实验

分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各5μL,按2.1项下色谱条件进样,记录色谱图。可见供试品溶液在与对照品溶液相应位置有吸收峰,阴性对照溶液在姜黄素出峰位置无干扰,见图1。

2.4 线性关系考察

取本品储备液(0.455mg.mL-1)1mL置10mL的量瓶中加甲醇稀释至刻度(0.0455mg.mL-1),分别精密吸取该对照品1、2、3、4、5、6 μL注入高效液色谱仪中,依法测定,以姜黄素对照品进样量X(μ g)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,计算回归方程为:Y=7.7869×106X＋2.4 7 4 7×1 0 4,R=0.9999,说明在0.0455～0.273 μg范围内,线性关系良好。

2.5 精密度实验

精密吸取对照品溶液(0.03185mg.mL-1)和供试品溶液各5μL,注入HPLC仪中,依法测定,重复进样6次,测定姜黄素峰面积,结果对照品RSD=0.80%(n=6),供试品的RSD=0.76%(n=6)。

2.6 稳定性实验

供试品溶液在配置后,分别于0、2、4、8、16,24h进行测定。观察峰面积的变化,结果表明峰面积在24h之内稳定,RSD=0.61%。

2.7 重现性实验

取同一批号5份,精密称定,按供试品溶液的制备方法操作,精密吸取各供试品溶液5μ L,依法测定,结果,样品的RSD=1.73%。

2.8 回收率实验

采用加样回收试验,取已知含量的样品6份,精密称定,每2份为1组,每组分别加入姜黄素对照品溶液一定量。按供试品溶液的制备方法操作,并依法测定姜黄素的含量,结果见表1。

2.9 样品含量测定

取3批样品(090502,090504,090506),分别按2.2.1项下处理,吸取样品溶液和对照品溶液各5μL,注入液相色谱仪,测定,结果3批样品中姜黄素含量分别为2.72mg.g-1,2.62mg.g-1和2.60mg.g-1,平均含量2.65mg.g-1。

3 讨论

(1)提取方法选择参照相关文献[4～6]被测成分姜黄素的理化性质,拟以甲醇为溶剂提取,对提取方法(回流法,超声法)、提取时间(20、30、40min)进行了比较。结果样品以甲醇为溶剂,超声提取30min基本提取完全,并简单易行;(2)测定波长选择 姜黄素对照品溶液用可见紫外分光光度计全波长扫描,结果姜黄素最大吸收波长430nm,故采用430nm作为HPLC检测波长。在该波长处测定不但灵密度高,且避免了杂质的干扰。(3)药典[1]中姜黄素测定采用C8柱,而一般实验室常备C18柱,经比较2者测定结果差异性不大,可互用。

[1]中国药典2005版[S].2005:186～456.

[2]王青虎,白玉霞.薄层比色法测定沙日嘎-4汤中姜黄素的含量[J].中国实验方剂学杂志,1998,4(5):12～13.

[3]吴桂碧.薄层扫描法测定姜黄中姜黄素的含量[J].华西药学杂志,1995,10(3):172～174.

[4]赵晓霞,田丰,胥云.RP-HPLC测定姜黄中姜黄素的含量[J].中国中药杂志,2003,28(8):782.

[5]韩刚,张义春,刘士勇.姜黄中黄素素含量测定方法比较[J].西北药学杂志,2005,20(1):15.

[6]陈晋红,李为荣,刘大为,等.姜黄药材中有效成分含量测定[J].中药新药与临床药理,2009,20(3):253.