Ⅱ型糖尿病动物模型研究进展＊

牟道华 谭正怀

(1.成都中医药大学,四川 成都 610072;2.四川省中医药科学院,四川 成都 610041)

着人们生活习惯、生活方式的改变,肥胖的人越来越多。与之伴随的是Ⅱ型糖尿病的发病率迅速增加。1980年全国l3省及北京市30万人口进行的糖尿病调查中,糖尿病患病率为0.609%。在不到30年后的2008年,全国14省市糖尿病和代谢综合征的患病率调查显示,我国糖尿病患病率达到9.6%,增加超过了15倍。换言之,目前我国糖尿病患病人数已经超过7千万[1]。

Ⅱ型糖尿病又称非胰岛素依赖型糖尿病(Non-insulin dependent diabetes mellitus,NIDDM),其特点为胰岛素抵抗、胰岛素分泌受损、空腹高血糖或餐后2 h高血糖。由于Ⅱ型糖尿病及其并发症的迅速蔓延已经成为严重威胁人类健康的世界性难题,为了找到能有效防治糖尿病及其并发症的药物或方法,相关动物模型则是其必不可少的重要工具。目前常用的Ⅱ型糖尿病的动物模型主要分为诱导性动物模型、自发性动物模型和转基因动物模型。现将相关研究进展综述如下：

1 诱导性Ⅱ型糖尿病动物模型

Ⅱ型糖尿病的发病与外界环境以及食物等因素密切相关,多数情况为多因素致病,如过量的能量摄入往往会加重胰岛的负荷致使胰岛功能受损,或胰岛功能本来就不足,加上食物的诱导,致使胰岛的分泌往往不能满足机体的需要,导致血糖升高。

1.1 食物诱导的糖尿病动物模型

食物诱导的Ⅱ型糖尿病动物模型与人类的发病情况类似,在新药开发、发病机理研究中具有极大的应用价值。许多动物都可通过食物诱导产生胰岛素抵抗、血糖升高甚至Ⅱ型糖尿病,但能够用于实验的动物主要有以下几种：

BDF1小鼠：该小鼠是用C57BL/6小鼠和DBA/2小鼠杂交繁殖而成,在此基础上,再喂以高脂饲料而培育出的肥胖型Ⅱ型糖尿病小鼠。该小鼠在喂以高脂饲料后,体重增长迅速,在第3～4个月时出现高血糖、糖尿和HbA1C升高等糖尿病症状。其糖耐量已明显受损,体外胰岛培养显示胰岛素含量降低,且胰岛素分泌对高浓度葡萄糖刺激不敏感[2]。

沙鼠：沙鼠生活在食物来源比较匮乏的草原和沙漠地区,常以灌木的叶子和种子为食。食物所含能量很少,但能保持健康,既不出现肥胖也无糖尿病发生。若给予标准热量实验室饲料4个月,会有部分沙鼠出现典型的代谢综合征症状群(肥胖、胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病和血脂紊乱)。若给予高能饲料1周,沙鼠则会出现高胰岛素血症,胰岛β细胞体积减为原来的

1/3,这些现象均与血糖浓度有密切的关联。沙鼠总是先出现高胰岛素血症,再出现高血糖,最终出现不可逆的糖尿病状态[3]。最近研究发现,在沙鼠动脉壁及血管平滑肌细胞有脂肪生成,其动脉壁脂类沉积和脂肪生成无关[4]。沙鼠的高脂血症并不是由于肠道吸收太多的脂类,而是因为糖尿病状态本身而引起的[5]。

尼罗河大鼠：用常规饲料喂养尼罗河大鼠后,该鼠首先出现高胰岛素血症,高血糖,不久后出现了高甘油三脂,高胆固醇,高血压。若用高脂饲料喂养则上述症状将会更早出现。研究发现这种大鼠糖尿病的出现是由于基因与饮食交互作用导致的[6]。

1.2 饮食诱导与STZ联合应用

对于一般动物而言,单纯用食物诱导成糖尿病往往会需要很长的时间,不宜作为研究对象。为缩短成模时间,人们往往采用复合的方法复制模型,如采用高脂饲料先将动物诱导肥胖、产生胰岛素抵抗,在此基础上再通过不同方法进一步损伤胰岛功能,使血糖进一步升高,最终导致糖尿病症状出现。Zhang等用高脂饲料喂养大鼠 4 w后,再腹腔注射STZ 30 mg◦kg-1两次,便可造成稳定的Ⅱ型糖尿病动物模型[7]。Sahin给予SD大鼠饲喂特殊制备的高脂饲料2 w后,腹腔注射40 mg◦kg-1的STZ,出现典型Ⅱ型糖尿病症状。Wang等用含有20%蔗糖和10%猪油的高脂饲料饲养4 w后一次性注射剂量为30 mg◦kg-1的STZ,通过测定每组大鼠的体重增长曲线、血糖水平、胆固醇、血甘油三酯水平等指标显示STZ加高脂饲料组的糖尿病特征极其明显。这种模型往往具有会出现胰岛素抵抗、高血糖等Ⅱ型糖尿病的特征,但常不会出现高胰岛素,因此该类模型可能不适宜于胰岛素增敏剂的研究。

2 自发性Ⅱ型糖尿病动物模型

遗传因素在Ⅱ型糖尿病的发生、发展中起着非常重要的作用,为深入研究其发病机理,人们通过多种途径开发出多种可以用于研究的遗传性Ⅱ型糖尿病动物模型。目前主要包括：db/db小鼠、ob/ob小鼠、NSY小鼠(Nagoya-Shibate-Yasuda mice,NSY mice),Zucker fa/fa与ZDF大鼠(Zucker diabetic fatty)大鼠、GK 大鼠(Goto-Kakisaki,GK)、OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty,OLETF)大鼠等。

2.1 db/db小鼠

由C57BL/KsJ近亲交配株常染色体隐性遗传衍化而来,属Ⅱ型糖尿病模型。由于不正常的剪接,使终止密码子过早的插入从而使长链瘦素受体Ob-Rb被替换成了短链瘦素受体Ob-Ra。因为Ob-Rb受体负责瘦素在下丘脑的调节食欲,体重,能量消耗的作用,缺乏Ob-Rb受体就会导致肥胖,尽管血清瘦素水平升高。在4周龄时,db/db小鼠糖耐量正常,便在8周龄时便会产生严重的糖尿病且会和ob/ob小鼠一样的肥胖。在大多数研究中,均发现db/db小鼠有早期的高胰岛素血症,血清脂肪酸和甘油三酯升高。动物在一个月时开始贪食及发胖,继而产生高血糖、高血胰岛素,胰高血糖素也升高,一般在10个月内死亡。db/db小鼠心脏收缩功能比ob/ob小鼠有更加明显的损伤,这可能是由于早期高血糖的原故。该小鼠会发生左心室扩大,心肌壁增厚,显示出明显的心肌肥大,心脏舒张功能也受损,可能是由于脂肪酸诱导的线粒体解耦联所致。db/db小鼠心肌线粒体超氧化物、丙二醛和4-羟基壬烯醛水平升高提示db/db小鼠心肌存在着氧化应激。心脏交感神经激活和副交感神经张力降低显示心肌自律神经紊乱[8]。

2.2 ob/ob小鼠

属常染色体隐性遗传Ⅱ型糖尿病动物。由于ob/ob小鼠瘦素基因突变,导致瘦素缺乏,C57BL/6 ob/ob小鼠4周龄时发生轻度肥胖,表现出了高胰岛素血症和糖耐量受损,但没有形成糖尿病。在第15周龄时ob/ob小鼠才发生严重的肥胖和糖尿病。某些ob/ob小鼠血清甘油三酯和脂肪酸水平升高,这取决于它的营养状态和年龄。除了摄食过量外,ob/ob小鼠还表现出体温下降,身体脂肪含量增加,能量消耗和活动度降低,不育或不孕,大约14月龄时死亡。研究表明ob/ob小鼠心肌收缩功能没有或者仅轻微的损伤,但舒张功能有明显紊乱,使心脏整体功能有一定的降低。当其心脏暴露于高浓度的脂肪酸中时,脂肪氧化和甘油三脂储存增加,葡萄糖氧化降低,心肌胰岛素抵抗加强。心肌线粒体呼吸容量减少并伴随着各种底物、ATP合酶解耦联。糖尿病ob/ob小鼠肝PPA RY2表达水平升高与胰岛素抵抗有关。口服雌酮硫酸盐(Estrone sulfate)可降低ob/ob小鼠肝葡萄糖-6-磷酸酶的活性和酶蛋白的水平,从而使血糖正常。研究发现它们和人类Ⅱ型糖尿病不同的是不具有血液的高凝状态,因此不能用于糖尿病心血管和脑血管并发症方面的研究[9]。

2.3 NSY小鼠

是从远交系JCl/ICR小鼠中选择葡萄糖耐量异常株培育而成的,其糖尿病发生与年龄、性别密切相关：24周龄时胰岛素分泌功能严重受损,48周龄的累积发病率雄性为98%,雌性为31%。此鼠在任何年龄阶段都不表现严重肥胖和显著的高胰岛素血症,胰岛也无肿大或炎性变化,研究发现染色体Chr11和Chr14共同影响NSY小鼠高血糖和肥胖,而其中单独的一个染色体却对血糖和肥胖无任何影响[10]。

2.4 ZDF(Zucker diabetic fatty)大鼠

Zucker fatty rat大鼠基因编码的瘦素受体发生了纯合子错义突变。这种突变发生在Fa基因序列中,导致Ob-R功能缺失。Zucker diabetic fatty大鼠起源于Zucker fatty rat选择育种,即选出其中血糖高者。因此Zucker diabetic fatty大鼠产生于Zucker fatty rat远交系的近交系品种。ZDF大鼠发生肥胖,高胰岛素血症,高血糖,高瘦素,以及高血清甘油三酯和脂肪酸,在第6周龄时便出现胰岛素抵抗。高血糖开始于第6周前后,在10到12周时出现稳定的高血糖,血清胰岛素水平开始下降,由于胰岛β细胞的不足。在ZDF大鼠中,心脏会发展成心肌肥大,脂类储存增加。脂肪酸氧化比率和其基因表达在ZDF心肌中都增加,而糖类氧化,丙酮酸盐脱氢酶流量、Glut4表达都降低。在ZDF中未观察到SERCA2a mRNA表达的改变[11]。。

2.5 GK大鼠

在1975年,Goto等人在日本仙台从211个Wistar大鼠中经口服糖耐量实验选出18个轻度糖耐量减退的大鼠,经过10代左右反复选择高血糖鼠交配,形成与人类Ⅱ型糖尿病近似的自发性非肥胖Ⅱ型糖尿病鼠种,称为GK(Goto—Kakizaki Rat)大鼠。该鼠种主要表现为胰岛β细胞分泌功能受损、空腹高血糖、肝糖原生成增多,肝脏、肌肉和脂肪组织中度胰岛素抵抗等,并出现各种糖尿病并发症。18月龄时GK大鼠即出现了血糖升高、心率降低、心肌萎缩等症状,与人类Ⅱ型糖尿病心脏病进展极为相似,并有显著的心肌肥大、间质纤维增生和持续的心肌细胞凋亡。在糖尿病中,心肌压力响应路径被认为是心肌重构的一个独立的危险因素。GK大鼠心肌梗塞所诱导的抑癌基因蛋白表达增加,Akt磷酸化减少和相伴的FOXO3a磷酸化减少可能导致了心肌细胞死亡增加,GK大鼠发生心肌梗塞后梗死区域Sirt1蛋白过度生成。这种现象与p53的乙酰化有关。当p38 MAP激酶长期处于激活状态时会促进GK大鼠心肌梗死后重建,间质纤维化,心肌肥大以及增加前促炎因子调节器的表达[12]。也有研究发现糖尿病GK大鼠的毒蕈碱受体系统改变可能导致糖尿病膀胱病的发生[13]。

2.6 OLETF大鼠

通过对Long-Evans大鼠进行杂交,筛选超重者进行近交而成。其胆囊收缩素(CCK)-A受体mRNA的表达完全缺失,携带的ODB1和ODB2基因与糖尿病的发病有关。多食、少动、肥胖和出现糖尿病的临床表现为主要特征。早期以胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱为主,以后逐渐出现胰腺功能减退,晚期合并糖尿病肾脏病变,与人类2型糖尿病极为相似。有资料显示,OLETF大鼠不仅缺乏外周的饮食饱足感信号,而且CART肽引起食欲缺乏的作用也减弱了[14]。

3 转基因动物模型

为阐明某一单个基因在Ⅱ型糖尿病发病中的作用,人们采用基因敲出或基因过表达等手段复制出一系列Ⅱ型糖尿病动物模型,但这种但基因改变的动物模型往往与临床具有一定的差距,其应用范围也受到很大的限制。

3.1 SREBP-2转基因小鼠

Ishikawa等为了研究胰岛β细胞合成胆固醇的作用,使用了一种胰岛β细胞SREBP-2转基因小鼠。该研究表明SREBP-2蛋白活化导致了大量β细胞凋亡和胆固醇聚积,产生严重的糖尿病。可以用于脂毒性及胆固醇代谢与β细胞功能损伤方面的研究[15]。

3.2 MODY模型[16]

MODY(Maturity-onset diabetes of the young,MODY),即青幼年发病的成年型糖尿病,是Ⅱ型糖尿病的一个亚型,有5种蛋白质的基因缺失或突变可以导致MODY,分别是肝细胞核因子 4α(HNF-4a/MODYl),葡萄糖激酶(GK,MODY2),肝细胞核因子 1α(HNF1a/MODY3),胰岛素启动因子(IPF-1/MODY4),肝细胞核因子 1β(HNF-1β,MODY5)。MODY2 模型是由于葡萄糖激酶基因第629位的核苷酸由T变成了G,导致了210号位蛋氨酸变成了精氨酸。由于这种突变,造成了成年突变小鼠肝脏葡萄糖激酶活性明显的降低,但是表达葡萄糖激酶的mRNA和这种蛋白质却并没有减少。纯合子的突变小鼠表现出严重的生长停滞和高血糖,并在出生后不久便死亡;而杂合子突变小鼠在出生后只表现出轻微的血糖升高和葡萄糖不耐受及葡萄糖诱导的胰岛素分泌紊乱。此外,雄性突变小鼠在90天后还表现出胰岛敏感性和空腹血清胰岛素水平降低。而纯合子与杂合子突变小鼠在出生时胰岛β细胞总数是相同的,但在210天后胰岛细胞和β细胞容积以及单独的β细胞容积发生了显著性的改变,这仅在雄性突变小鼠中有所发现[17]。

3.3 KK-Ay小鼠

KK小鼠是日本学者培育的一种轻度肥胖的Ⅱ型糖尿病动物,将黄色肥胖基因(即Ay)转至KK小鼠,得KK-Ay小鼠。与KK小鼠相比,KK-Ay小鼠有明显的肥胖和糖尿病症状。具有高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、糖耐量受损、过量饮食等症状。2月龄时开始出现中度肥胖,4～5月龄时进入稳定期,脂肪约占总体重量的33%;并逐渐出现角膜退化、皮肤上皮细胞坏死等症状;15周龄时还会出现心肌间质纤维化;后期的肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质积聚会进一步恶化形成糖尿病肾病。KK-Ay12周龄以后的尿蛋白、血肌酐、体重、随机血糖、空腹血糖、血红蛋白、血压、终末糖基化产物和转化生长因子-β等指标均明显高于其对照组 BALB/c小鼠,出现典型的Ⅱ型糖尿病症状[18]。KK-Ay小鼠的糖尿、体重、空腹血糖水平与基因Guq1和Guq2有着复杂的关联。其糖耐量和血清胰岛素则随着年龄的增加而恶化[19]。

4 总结

一种良好的动物模型必须具备以下条件：稳定可靠,易于重复;经济易得;复制成功所需时间短,其主要表现与临床表现相似。综上所述,目前各种Ⅱ型糖尿病模型有其各自的优缺点,如：诱导性动物模型价格低廉,可操作性强,但与临床实际情况相差较远,常影响到研究结果的可靠性;自发性动物模型的发病机制、病理变化以及临床表现与人类Ⅱ型糖尿病的发病机制相似,但其价格较贵,饲养条件要求严格,周期长,使其应用受到了极大的限制;而转基因动物模型多为单一基因的敲除或过表达,其针对性较强,是探讨个别基因在糖尿病发病中的作用和地位的最佳选择,但制作技术难度较高,目前在国内外应用均受到了一定的限制。因此,复制一种周期短、与人类发病机制相似的Ⅱ型糖尿病动物模型是研制、开发防治Ⅱ型糖尿病及其并发症药物急需解决的难题。

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