红车轴草异黄酮的生理及药理作用的研究进展

刘宝剑,魏彦明

(1.河北北方学院教务处,河北张家口075000;2.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070)

红车轴草 (Trifolium pratense L.)为豆科多年生草本植物,又名红三叶、红花苜蓿、红菽草、三叶草等,原产于小亚细亚和西南欧,在欧洲各国及俄罗斯、新西兰等国海洋性气侯广泛栽培.在我国新疆、吉林、云贵高原、湖北鄂西地区都有野生,适宜在我国亚热带高山低温多雨地区种植.目前,红车轴草有许多适应不同环境的优良品种,各地可因地制宜选用,在甘肃岷县等县区已引种多年,且大面积推广种植.红车轴草主要含有黄酮类、蛋白质、氨基酸、糖类和维生素等多种成分,黄酮类中最主要的是异黄酮,其中以鹰嘴豆芽素A(Biochanin A)、芒柄花素 (Formononetin)、染料木素 (Genistein)、大豆素(Daidzein)等4种为主.研究表明红车轴草异黄酮具有弱的雌激素样作用、促进动物生长、抑制癌细胞的生长、改善动脉血管的柔软性等多种生理功用.

1 抗氧化作用

1.1 清除自由基

自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和某些疾病如癌症、心血管疾病等的重要因素.体内过多的氧自由基 (其中·OH化学性质最活泼)将作用于蛋白质、核酸、脂类等生物大分子,造成细胞结构和功能受损,进而导致物质代谢紊乱而引起疾病.清除自由基,主要依赖机体内的酶系统与非酶系统.已有文献报道中草药的独特疗效与其作为抗氧化剂,高效清除体内自由基作用密切相关.Wei H C等[1]研究认为,染料木素 (Genistein)强烈抑制12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate;TPA)诱导的髓样白血病细胞株 HL-60细胞中 H2O2的形成,对黄嘌呤氧化酶产生超氧阴离子也具有抑制作用.异黄酮能保护DNA不被氧化破坏,有效消除紫外线引起的8羟基脱氧鸟苷 (8-OHdG)形成和小牛胸腺DNA的损伤[2].异黄酮还能抑制小鼠肝组织匀浆液中脂质的过氧化作用,能防止维生素C的氧化[3].一定浓度的红车轴草异黄酮体外能清除超氧阴离子自由基及羟自由基作用[4].

1.2 抗氧化和对自由基损伤保护作用

Guoetal[5]研究表明,在5 nmol/L生理浓度下,染料木素和大豆黄素分别提高细胞内还原型谷胱甘肽水平约10%和30%.杨丽珍等[6]实验研究表明,大鼠因内分泌改变,有关器官逐渐衰老,清除自由基能力和抗氧化能力下降,并进而出现脂质过氧化作用增加,自由基清除酶类活性下降等变化.经红车轴草异黄酮高、低剂量及大豆异黄酮、倍美力组治疗6周后,MDA浓度降低 (P＜0.01或P＜0.05),SOD活性显著升高 (P＜0.01或P＜0.05),且红车轴草异黄酮抗氧化作用优于倍美力,说明红车轴草异黄酮通过提高SOD活性,降低MDA浓度,达到提高机体清除氧自由基能力,从而有效延缓衰老.

1.3 对脂质过氧化也具有较好的抑制作用

朱宇旌等[7]用红三叶黄酮粗提物实验进行抗氧化效果进行比较,添加红三叶黄酮粗提物对猪油具有良好的抗氧化作用,其中以添加0.2%抗氧化效果最佳,与Vc的抗氧化性相当,比抗氧剂BH T效果好;另外Vc和VE等对红三叶黄酮粗提物具有明显的协同抗氧化作用,效果优于单独添加0.2%黄酮粗提物和Vc、BHT.

对红车轴草异黄酮抗氧化活性的研究,多集中在其几种单体的研究,而对红车轴草总黄酮抗氧化及体外清除自由基的实验研究鲜见报道,抗氧化效果如何有待进一步研究.

2 对免疫机能的影响

2.1 提高机体免疫力作用

异黄酮能提高动物机体细胞免疫、体液免疫.Wang W,et al.报道[8],大豆黄酮显著提高刀豆素A(ConA)或脂多糖 (LPS)诱导的脾淋巴细胞增殖反应.大豆黄酮还可促进ConA诱导T淋巴细胞产生白介素-2(IL-2)和白介素-3(IL-3).张荣庆等[9]研究表明,每天给小鼠灌服芒柄花素 (Formononetin)或大豆黄酮 (Daidzein)明显提高正常小鼠胸腺重量和腹腔巨噬细胞吞噬功能,提高空斑形成细胞的溶血能力和外周血T淋巴细胞百分率;体外试验表明,芒柄花素或大豆黄素明显促进植物血凝素 (PHA)诱导的甲基-3H胸腺嘧啶核苷 (methyl-3H TdR)参与的淋巴细胞转化.张荣庆等[10]试验还表明,妊娠后期摄入大豆黄酮 (Daidzein)可明显提高母猪对猪瘟疫苗抗原刺激产生的特异性免疫应答反应,血清和初乳中猪瘟抗体和溶血素水平显著提高,其新生仔猪血清中母源抗体水平亦显著提高.

2.2 对淋巴细胞活化增殖和周期的影响

红车轴草异黄酮对淋巴细胞活化增殖有一定影响.林长乐等[11]利用碘化丙啶 (PI)染色流式检测法发现Biochanin A也能使增殖的T淋巴细胞停滞于G0/G1期,提示干预 T细胞周期分布可能与上述周期相关蛋白有关.另外,实验还发现Biochanin A能够下调 T淋巴细胞表面标志分子CD3的表达密度,且呈现明显的浓度依赖性.表明Biochanin A对小鼠T淋巴细胞的活化增殖和周期具有明显的抑制作用.

林长乐等[12]还研究了鹰嘴豆芽素A抗H IV-1活性及抑制CD4+淋巴细胞早期活化作用,发现Biochanin A具有抗 H IV-1介导的细胞融合和 H IV-1复制的活性及抑制CD4+淋巴细胞早期活化作用.

3 植物激素样作用

3.1 提高畜禽生产性能指标

红车轴草异黄酮具有弱的雌激素样作用,能提高畜禽的生产性能.王国杰等[13]首次证明日粮中添喂红三叶草异黄酮植物雌激素能促进公仔鸡睾丸和鸡冠发育,使血清睾酮水平显著提高,在连续饲喂12 d期间生长速度和饲料利用效率均有所提高,提示异黄酮植物雌激素作为饲料添加剂在促进家禽生长上具有潜在的应用前景.张荣庆等[14]研究表明异黄酮植物雌激素具有弱的雌激素活性,能抑菌,抗菌,提高机体的免疫机能,对畜禽有防病治病的作用.王伟群等[15]研究表明红三叶草中的芒柄花素具有弱的雌激素活性,引起小公鸡血清睾酮水平升高,提高瘦肉率,促进家禽生长的确切生理学机制尚待进一步探讨.

3.2 雌激素样作用

红车轴草异黄酮具有雌激素样作用,增加雌性激素及雌性器官重量等指标.Burdette J E等[16]实验用红车轴草提取物强饲缺乏雌二醇未孕雌鼠、50日龄卵巢切除鼠21 d.数据提示红车轴草提取物能剂量依赖性增加子宫重量,且两个高剂量组能剌激阴道细胞分化,但不能刺激乳腺细胞的增殖.在许多组织中既无抗雌激素也无雌激素的累加.这些数据表明,红车轴草提取物 (含15%标准异黄酮)对切除卵巢的斯普拉-道来 (氏)大鼠 (Sp rague-Daw ley Rat)模型实验,具有弱的雌激素样作用.

也有学者实验认为,红车轴草异黄酮能增加乳腺密度,对雌二醇等没有影响.A tkinson C等[17]研究红车轴草异黄酮在乳腺组织中是否有雌激素和抗雌激素样作用,结果表明,常规雌激素替代疗法增加乳腺密度,异黄酮补充物则不能增加妇女乳腺密度.此外,对雌二醇、促性腺素、淋巴细胞酪氨酸激酶活性或者绝经期症状没有影响.

杨丽珍等[18]实验,中老年雌性大鼠予以红车轴草异黄酮胃饲后,与老年模型组相比,雌二醇 (E2)水平有极显著升高 (P＜0.01),同时促黄体激素 (LH)水平有极显著下降 (P＜0.01),促卵泡激素(FSH)亦有显著下降 (P＜0.05),说明红车轴草异黄酮可改善老年雌性大鼠内分泌状况,阻止下丘脑-垂体-性腺轴机能减退.红车轴草做为雌激素的替代品在国外被广泛应用于人的绝经期相关疾病的治疗,对于疗效观察与研究还有待深入.

4 抗癌细胞作用

4.1 红车轴草提取物能通过抑制相关酶类等多种途径而发挥抗癌作用

Roberts D W等[19]研究表明,鹰嘴豆芽素A和 (或)芒柄花素可通过直接竞争细胞色素 P-4501(CYP1)B1结构发挥抗癌作用或间接通过它们的代谢产物大豆黄素和染料木黄酮抑制CYP1 B1而发挥抗癌作用.Lam AN等[20]研究测定基于红车轴草异黄酮的抑制鼠巨噬细胞株RAW 264.7和人类单核细胞环氧化酶活力.异黄酮在1～40μmol/L范围内对RAW 264.7细胞和在10～100μmol/L浓度范围内对人单核细胞具有显著减少前列腺素E2的合成物和 (或)血栓烷B2(Throm boxane B2)的能力 (P＜0.001 to P＜0.05),表明对环氧化酶的抑制作用.因此,推测癌症低发率人口与高摄入异黄酮的抑制环氧化酶活性相关的.

4.2 通过诱导细胞凋亡而发挥抗癌作用

学者通过不同方法研究了红车轴草提取物对癌细胞的影响,认为能抑制癌细胞的增殖或诱导癌细胞的凋亡.Fung M C等[21]研究认为鹰嘴豆芽素A不仅能剂量依赖性地抑制髓细胞性白血病WEH I-3B细胞的生长,而且也能诱导W EH I-3B细胞形态的分化.郑杰等[22]用不同浓度的红车轴草提取物处理BGC-823癌细胞,研究对其抑制增殖效应及诱导凋亡作用,实验结果表明红车轴草提取物能抑制胃癌BGC-823细胞增殖,能诱导胃癌细胞凋亡.Cassady J M等[23]实验通过测定苯并芘在仓鼠胚胎细胞培养物中代谢的影响,来探讨鹰嘴豆 (芽)素A抑制致癌物对细胞的作用.结果表明95%的酒精红车轴草提取物显著抑制苯并芘的代谢,使其与DNA结合水平降低了30%到40%.鹰嘴豆芽素A可以抑制通过碳氢化合物诱导的癌,能有力校正芳族碳氢化物与哺乳动物DNA的结合以及它们的致癌活性.

尹春萍等[24]利用 TUNEL法、流式细胞术分析研究表明,红三叶总异黄酮对MCF27细胞增殖的抑制作用随药物质量浓度提高和作用时间延长而更加明显,而在低质量浓度时却出现轻微促细胞增殖现象,红三叶总异黄酮能诱导MCF27细胞凋亡,阻滞细胞于 G2/M期,降低细胞增殖指数,具有抗肿瘤作用.

4.3 抗乳腺癌作用

M izunuma H等[25]用两种异黄酮 (鹰嘴豆芽素A、大豆黄素),通过小鼠乳房肿瘤病毒诱导的自发乳腺癌细胞模型来验证异黄酮的抗癌作用.认为系统的抗癌效果可能不是通过大豆黄酮或牛尿酚,而是鹰嘴豆芽素A或染料木黄酮,来自于鹰嘴豆芽素A的染料木黄酮在肠道的微生物群的代谢过程中更可能扮演了一个抑制乳腺癌的角色,并认为鹰嘴豆芽素A可能是染料木黄酮的前体.

4.4 防治前列腺癌

Slater M等人[26]研究,在饲喂红车轴草异黄酮小鼠的前列腺上皮细胞显示雌激素β受体和上皮细胞钙粘蛋白显著的增加,但使转化生长因子β1降低.这些蛋白是被雌激素诱导增殖的、维持组织结构、保持细胞表现型、减少瘤细胞的生成和转移转化的标记物.表明红车轴草异黄酮对于前列腺增生能减少潜在的致瘤性转化.Renea A Jarred等[27]研究表明,饮食中添加红车轴草异黄酮可以通过诱导前列腺癌细胞的凋亡抑制前列腺癌的发展,可以降低亚洲人的前列腺癌的发病率.证明通过摄入红车轴草异黄酮 (160 mg/d)可以诱导前列腺癌细胞凋亡.

5 防治骨质疏松

许多学者从不同角度,用不同方法研究红车轴草异黄酮对骨质疏松的影响,结论基本一致,认为红车轴草异黄酮对骨质疏松有一定的防治作用.李颖等[28]的研究表明红车轴草异黄酮具有提高雌激素作用,可有效抑制骨吸收,降低骨转化率,加强成骨细胞活性,增加骨密度,对去卵巢引起的大鼠骨质疏松症具有明显的防治作用.陈琦等[29]研究结果表明,红车轴草异黄酮通过提高血清雌激素水平,增加成骨细胞活性,降低骨高转换率以及减少骨量丢失等多种途径,能有效防治绝经后骨质疏松症.

Clifton-Bligh PB等[30]研究了红车轴草提取物对绝经期妇女脂质和骨代谢的影响,结果表明,服用红车轴草异黄酮复合提取物与显著增加高密度脂蛋白胆固醇、血清载脂蛋白B显著下降、6月后近端桡骨和臂骨的骨矿物质密度显著升高有着相关性.Wende K等[31]测定红车轴草不同提取物剌激成骨细胞骨肉瘤HOS58细胞的活性的能力.选择碱性磷酸酶 (ALP)作为成骨细胞活性的关键标记.然而丁醇和甲醇提取物对ALP和细胞蛋白产物是没有影响的,对与氯仿提取物孵育的酶活有显著增强.表明红车轴草异黄酮在激活成骨细胞活性上具有一定作用.A tkinson C.等人[32]实验研究表明为妇女每天提供红车轴草异黄酮—鹰嘴豆芽素A 26 m g、芒柄花素16 m g、染料木黄酮1 mg、大豆黄素0.5 mg,一年时间.能减弱骨质的流失,可能对妇女的腰椎具有保护作用.

6 对妇女绝经期症状的影响

在国外,雌激素替代疗法对防治妇女绝经期症状的相关研究很多,特别是从植物中诸如大豆、红车轴草等提取黄酮类有效成分用来防治妇女更年期疾病的研究比较深入,得出的结论也不尽相同.

Coon J T等[33]利用元分析研究了红车轴草异黄酮治疗绝经期热潮红效果,认为红车轴草异黄酮在治疗绝经期妇女热潮红具有非常显著的统计学意义,能减少热潮红发生频率.Krebs E E等人[34]根据文献对植物雌激素治疗绝经期症状的功效和耐受性进行评述,认为植物雌激素如大豆食品、大豆提取物,红车轴草提取物不能改善热潮红或其它绝经期症状.Schult T M等人[35]研究比较两种补充红车轴草异黄酮添加物对绝经期妇女的脂质和骨丢失标记物的影响.与对照组比较,对骨质的影响没有显著的统计学意义,两种异黄酮补充物能减少有绝经期症状妇女甘油三脂的水平,但这种影响在强度上是很小的.

7 对绝经妇女认知功能的影响

Howes JB等人[36]研究红车轴草异黄酮食品添加物对绝经后妇女认知功能的影响,说明异黄酮补充物在绝经期妇女认知功能上没有显出主要短期的作用,但需要进一步临床试验确定是否有小的作用或者在异黄酮补充期间对认知其功能的长期作用.

8 对心血管系统的影响

A tkinson C等人[37]研究红车轴草异黄酮对心血管风险因子的作用,测试总胆汁、LDL胆固醇、甘油三酯、HDL胆固醇、心脏收缩和舒张压、血纤蛋白原、纤溶酶原激活物抑制剂1(PA I-1)等相关指标.认为饮食中补充红车轴草衍生物对更年期妇女心血管风险因子有一定的保护作用,证明与49～65岁更年期妇女的载脂蛋白E(Apo E)基因型相互作用有关,但异黄酮单体对血脂的作用不像已被证明的那样作用明显.Teede H J等[38]研究表明,对血压正常的绝经期女人食入红车轴草异黄酮 (Formononetin芒柄花素)可以防治动脉血管硬化和减少总血管阻力,但对血压没有影响.Nestel P J等人[39]实验显示摄入红车轴草异黄酮,对改善全身组织动脉血管的顺应性来减少冠心病冠状动脉硬化性心脏病的风险因素,有显著的效果.

近年来,特别是在“回归自然”绿色浪潮的推动下,对天然产物有效成分的提取分析与应用研究成为热点,对优良豆科牧草-红车轴草的相关研究也有逐年增加趋势.研究表明,红车轴草在抗氧化、防止骨质疏松、抗癌、促进动物生长、提高机体免疫力、治疗妇女更年期综合症等方面具有作用.研究也发现,在对妇女更年期综合症实验中,得出的结论也不一致,应就此方向进行更深入研究,以期得到更准确的研究结果.同时,也应在畜禽饲料方面做一探讨,发挥红车轴草的药用及饲用价值,为其深加工提供参考.

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