治疗附红细胞体病中药复方的筛选试验

魏香蒲,崔 平,方素芳,顾小龙

(1.张家口市高新区农委,河北张家口075000;2.河北北方学院动物科技学院,河北张家口075000)

猪附红细胞体病是由猪附红细胞体寄生于猪红细胞表面或血浆中引起的一种人畜共患病[1].近年来,随着养猪业的迅速发展,该病在国内部分省区呈爆发流行.至今,我国已有14个省市20多个县发现此病.2006年方素芳等对河北省猪附红细胞体病进行流行病学调查发现,河北省部分地区猪附红细胞体感染率达91.8%[2],给养猪业造成极大损失.生产中猪受某些应激因素 (如寒潮冷、长途运输、饥饿、转栏、争斗、拥挤等)影响导致抵抗力下降时,则呈现急性感染而出现明显症状[3],且经常继发或并发其他感染和疾患,导致病情加重,有的甚至短期内死亡[4,5].

目前由于对附红细胞体病了解甚少,己严重造成临床上乱用和滥用各种抗寄生虫药物和抗微生物药物,这有可能导致药物残留和危害食品安全[6].寻求一种简便、高效的治疗猪附红细胞体的中药方剂势在必行,我们进行了本实验,为找到治疗附红细胞体病的合适药物和治疗方法提供一定的理论根据.

1 材料与方法

1.1 材料

小白鼠：河北北方学院物资科动物室繁殖的昆明种,体重为18～25 g的健康小白鼠,雌雄各半.

药物：金银花、野菊花、青蒿、生地、鱼腥草、柴胡、常山、槟榔、大黄、芒硝、黄芩、连翘、石膏、苦参、当归、黄芪、川芎、赤勺、甘草等方药组成.所有中药均购自张家口市南山堂大药房.

1.2 方法

1.2.1 自拟复方中药的筛选试验

1.2.1.1 猪附红细胞体阳性血液样本的制备

无菌采取有明显临床症状的猪血液,用柠檬酸—柠檬酸盐—葡萄糖 (ACD)抗凝 (ACD与血液比为1∶5).经血液压滴标本检查,400倍镜下观察红细胞感染附红细胞体在90%以上.试验时每只小白鼠腹腔注射0.5 m l猪附红细胞体阳性血液.

1.2.1.2 复方中药的制备

金银花、野菊花、青蒿、生地、鱼腥草、柴胡、常山、槟榔、大黄、芒硝、黄芩、连翘、石膏、苦参、当归、黄芪、川芎、赤勺、甘草等方药,经鉴定后组成方剂1、方剂2,煎成汤剂,保存于4℃冰箱备用.

1.2.1.3 试验动物分组

将60只感染小白鼠随机分为3组,每组20只,第1组为附红细胞体阳性对照组;第2组为方剂1治疗组;第3组为方剂2治疗组.治疗组在感染附红细胞体4 h后灌胃,每次0.5 m l,连续5天给药,每天1次;另取20只未感染小白鼠作为生理盐水对照组.灌胃方法及用药剂量同治疗组.

1.2.2 复方中药的安全性试验

1.2.2.1 急性毒性试验

复方中药水煎液的制备 将配好的复方中药置砂锅内,加入6～8倍的冷水浸泡30～60 min,用火加热,开始用强火,沸后改用文火,煮沸30 min,用纱布过滤.药渣加3～5倍量水继续按上法煎煮,沸后煎煮30 min,滤过,合并得两次滤液,于水浴上浓缩成每毫升相当于原药材1 g的药液,即配成100%的水煎剂,经高压灭菌20 m in,冷却后置冰箱中备用.试验前按需要稀释.

复方中药醇提液的制备 取原药100 g,加95%乙醇200 m l浸泡24 h,倾取上层液过滤于蒸发皿内,残留再加100 m l乙醇提取二次,合并提取液滤液,自然干燥得提取物.提取率为9.12%.临用前按需要进行稀释.

动物分组 取健康小白鼠30只,雌雄各半,随机分成6组,每组5只,分别采用水煎剂灌胃和腹腔注射醇提液两种给药途径,按kg体重5g、15g和20g三个剂量,加适当倍数的水使每只小白鼠灌胃量在0.4～0.8 m l.醇提液加注射用水适量使每只小白鼠注射量也为0.4～0.8 m l.

1.2.2.2 亚慢性毒性试验

取健康小白鼠48只,雌雄各半,随机分为三组,每组16只,第1组为对照组,第2组和第3组分别将复方中药按10%和20%比例混入小白鼠饲料中,然后做成块状饲料喂给小白鼠,组内雌雄分开饲喂,喂养期90 d.

2 结果与分析

2.1 复方中药的筛选试验结果

2.1.1 自拟方剂对正常小白鼠的影响

复方中药阴性对照组小鼠在给药期间未出现异常反应,小鼠存活时间与正常小鼠存活时间差异无显著性 (P＞0.05),表明自拟方剂对小鼠无明显毒害作用.

2.1.2 自拟方剂对感染小白鼠附红细胞体的杀灭效果

阳性组小白鼠人工感染附红细胞体后的第2～3 d,经血液压滴标本检查,可见红细胞有附红细胞体感染,在感染后的第4～5 d红细胞感染率达到80%,第6～7 d红细胞感染率相继达到90%以上,红细胞上的附红细胞体附着个数最高达20个.方剂1治疗组第2 d之后感染率逐渐下降,但一直维持在20%～10%之间;方剂2治疗组小白鼠在用药后第1 d红细胞感染率就迅速下降,第5 d感染率下降至2%,生理盐水对照组一直处于0.结果见表1.

表1 自拟方剂对感染小白鼠附红细胞体的治疗效果单位：感染率/%

2.2 复方中药的安全性试验结果

2.2.1 急性毒性试验

用药后每天观察小白鼠的状况,连续7 d,各组小白鼠均无死亡,未出现中毒症状.在此基础上,另取20只小白鼠分成两组,按kg体重20 g剂量采用上述两种途径给药,24 h内未见死亡,72 h后又重复给药一次,并连续观察7 d,小白鼠无死亡,且健康活泼,食欲良好.结果表明,该复方中药LD50＞20 g/kg,按急性毒性分级属无毒物.

2.2.2 亚慢性毒性试验结果

临床检查在90 d试验期内观察,各组小白鼠饮食、粪便、体态、运动、声、光反射均未见异常,无死亡.

血常规检查 试验喂养90 d进行,结果见表2.

表2 血常规检查结果

由表2可知,各组血常规各项指标均属正常.

肝体比、肾体比 在第90d进行测定,结果见表3.

对表2和表3结果分别与1组进行t检验,P＞0.05,说明两试验组的肝体比和肾体比均属正常.

尸体剖检 采血致死后尸体剖检,各组小白鼠心、肝、脾、肺和肾的大小、颜色、质地均未见异常.

病理组织切片 检查取肝、肾材料,用石蜡切片法制成组织切片,经苏木精-伊红 (HE)染色,显微镜下检查,三组均未见异常.

表3 肝体比、肾体比测定结果

3 结论与讨论

中兽医理论认为附红细胞体病属温热症,热势偏盛,是由感受外邪,燔灼气血所致,临床特征是发热、贫血、黄疽、红细胞自凝和红细胞的沉降率增加,缺乏血红蛋白.本方剂所选中草药可达到解表、凉血、清里、滋阴等作用[7].其中金银花、野菊花清热解毒;鱼腥草清肺热;生地补阴凉血;青蒿、常山抗原虫;大黄、芒硝清热通便;柴胡、茵陈、常山、槟榔透解邪热,疏达经气,祛邪解毒;丹皮、黄芩清泄邪热,凉血化瘀.另据实验报道表明：天花粉、黄芪等中草药对红细胞免疫功能具有增强作用[8].

试验观察了自拟方剂对感染小白鼠附红细胞体的杀灭效果,结果表明方剂1治疗组第2 d之后感染率逐渐下降,但一直维持在20%～10%之间;方剂2治疗组小白鼠在用药后第1 d红细胞感染率就迅速下降,第5 d感染率下降至2%.自拟方剂阴性对照组小鼠在用药期间无任何不良反应,且其生存时间与正常小鼠生存时间一致,表明自拟方剂本身毒性较小,因此复方中药是低毒,疗效确切的抗附红细胞体药物,为临床应用提供了试验依据.

复方中药对小鼠进行的急性毒性试验和亚慢性毒性试验,采用水煎剂和醇提液两种给药途径,按kg体重5 g、15 g和20 g三个剂量以及在90 d试验期内的观察.结果表明,用药后各组小白鼠均无死亡,未出现中毒症状.血常规检查、肝体比、肾体比、尸体剖检、病理组织切片检查均无异常.说明该复方药物在适宜剂量时属无毒物.

[1] 吴雅玲.附红细胞体病 [J].青海畜牧兽医杂志,2001,31(04)：47-48

[2] 方素芳,崔平.河北省猪附红细胞体病的流行病学调查 [J].河北北方学院学报：自然科学版,2007,23(01)：38-40

[3] 程海庆,郝瑞芳,李海峰.猪弓形虫与附红细胞体病混合感染的诊治 [J].河南畜牧兽医,2002,23(09)：12

[4] 李星,李邹然.猪伪狂犬病病毒和附红细胞体混合感染的诊断 [J].中国兽医科技,200l,32(09)：31

[5] 王永掸,陈保国,张新疆,等.猪链球菌与附红细胞体混合感染的诊治 [J].河南畜牧兽医,2001,23(03)：23

[6] 郑海红.猪附红细胞体体外培养及有效药物筛选研究.[D].郑州：华中农业大学,2005

[7] 于船.中兽医学 [M].北京：中国农业出版社,1978：479

[8] 王彩虹.红细胞免疫调控研究进展 [J].中国兽医杂志,2002,28(02)：28-31