有机溶剂体系中癸酸甘油酯的酶法合成

李 论

(江苏省淮安质量技术监督局,江苏淮安 223001)

有机溶剂体系中癸酸甘油酯的酶法合成

李 论

(江苏省淮安质量技术监督局,江苏淮安 223001)

从最常用的有机溶剂体系着手,进行了有机溶剂体系中脂肪酶催化辛酸与甘油酯化制备功能性中链甘油酯的研究,探讨酶量、反应时间、反应温度、底物比率等对反应的影响。

有机溶剂;癸酸甘油酯;酶法合成

目前,用于酶促反应的非水介质主要包括:①与水混溶的有机溶剂和水形成的均一体系;②水与有机溶剂形成的两相或多相体系;③含微量水的有机溶剂;④超临界流体;⑤反相胶束;⑥无溶剂体系;⑦离子液[1]。超临界流体和离子液是两种绿色反应介质,其在脂肪酶催化反应方面的应用也有报道[2-3];但其作为一种反应介质在油脂改良方面的研究报道却非常少。目前在甘油酯的合成中,应用最多的是含微量水的有机溶剂体系和无溶剂体系。

1 材料和方法

1.1 材料

固定化脂肪酶(Lipozyme,来自Candida rugosa)、癸酸、癸酸甘油单酯,癸酸甘油二酯和癸酸甘油三酯均购自Sigma-Aldrich公司(Steinhe im,Germany)。甘油和其他试剂为分析纯或色谱纯。

1.2 酯化反应

将3.0mmol癸酸、1.0mmol甘油加入到装有3mL正己烷的10 mL带螺旋盖的玻璃试管中,旋紧盖子,在反应温度下预热使反应物溶解并混合均匀,然后加入50.0 mg固定化脂肪酶。反应混合物在40℃旋转水浴锅中以150 r/min的转速反应24 h。加入3.5 mL乙醇/丙酮(1∶1,体积比)终止该反应。采用乙酸铜法测定反应混合物中剩余的游离脂肪酸量。每次测定的百分比转化率表示为消耗癸酸物质的量占起始癸酸物质的量的百分比。

1.3 产品组成的鉴定

酯化反应在最佳的反应条件下进行。最佳反应条件为:温度,40℃;时间24h;底物物质的量比2.5;脂肪酶100.0 mg。反应结束后,反应混合物通过无水硫酸钠柱子除掉水分和脂肪酶。用薄层层析法对反应混合物进行分离(GF254硅胶板,厚度1 mm,20 cm×20 cm),展开剂为氯仿∶丙酮(9.5∶0.5,体积比)。

1.4 产物的液相色谱(HPLC)分析

丙酮作为溶解样品的溶剂,取10μL样品进行HPLC分析。HPLC系统为美国Agilent公司仪器,配有R I检测器和ODS-C18色谱柱(5μm,4.6 mm×250 mm,Agilent),以乙腈∶乙酸(94∶6,体积比)作为洗脱溶剂,采用梯度洗脱。梯度程序为:起始洗脱剂流速1 mL/min,保持7 min,然后在1 min内线性增加到2 mL/min,保持8 min,最后在1 min内线性降到1 mL/min,保持3 min。

2 结果与讨论

2.1 时间对酯化反应的影响

在酶催化反应中,要以最低的生产费用获得最高产物量,反应时间是确定最佳反应条件中必需研究的一个关键因素。随着反应时间的延长,转化率增加。尤其在0～16 h之间,酯化初始速率增加很快,超过16 h后,转化率的增长速度较慢。

2.2 有机溶剂对酯化反应的影响

当酶悬浮于有机溶剂中时,酶构象的改变导致其底物专一性、立体选择性的改变和稳定性的提高。有机溶剂的极性对于酶的催化活性至关重要,因为它影响着酶表层结合水的多少。在癸酸与甘油的酯化反应中,为了选择出一种适宜的有机溶剂作为反应介质,对不同的lgP值的有机溶剂:丙酮(lgP=-0.23)、乙酸乙酯(lgP=0.68)、氯仿(lgP=2.0)、正己烷(lgP=3.5)、正庚烷(lgP=4.00)、异辛烷(lgP=4.2)、正辛烷(lgP=4.5)、正癸烷(lgP=5.60)进行了研究。脂肪酶在正己烷、异辛烷、正辛烷和正庚烷等非极性有机溶剂中比极性有机溶剂表现更活跃。lgP(给定溶剂在水和正辛醇中的分配系数)>2.00的非极性有机溶剂被证明是最合适的溶剂。本研究结果表明,正己烷和异辛烷是Lipozyme催化癸酸与甘油酯化反应的最佳溶剂。

2.3 底物物质的量比对酯化反应的影响

在酶催化的反应中,底物比率对酶的催化活性有很大的影响。在本研究中,保持癸酸的量不变(3 mmol),同时改变辛酸的量(0～30 mmol),希望能以最佳的底物比率获得最大转化率。从理论上讲,高的底物比率应该使反应向产物方向移动,癸酸转化率也相应提高,但事实并非如此。最佳的癸酸甘油物质的量比为2.5,超过此比例,转化率没有提高,反而下降。反应混合物中的甘油过剩抑制了酶的活性。过量甘油导致大量的酶溶解在甘油中,从而降低了界面脂肪酶浓度,可能降低反应速率。

2.4 酶量对酯化反应的影响

在酶催化反应中,酶量也是一个关键的因子。它决定着反应进程的快慢。在一定条件下加大酶量,可以加快反应速度,提高产物转化率。随着脂肪酶量增加,MCG的合成量也增加。当脂肪酶超过100.0 mg时,MCG的产量没有显著增长。酶量的不断增大可以提高酯化反应的进程,但逆反应进程同时也加快。另外,过高的酶量还会带入体系过多的水分,而且酯化反应本身就会形成一定量的水,因此随酶量增加,水解副反应发生的进程也会加快。故过高酶量并不一定有利于产物产量的提高。

2.5 初始水活度(aw)对酯化反应的影响

酶需要少量的水维持其活性的三维构象状态,即使是共价键键合到一个支持物上的酶也不例外。水影响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和稳定性。酶周围水的存在,能降低酶分子的极性氨基酸的相互作用,防止产生不正当的构象结构。控制水分活度对于脂肪酶发挥催化活性非常重要。在一定范围内,随着水分增加酶活性也逐渐提高,但水分过多又会导致酶活性的降低和甘油三酯的水解。因此对于一个特定的反应,必须确定其最适水量。

2.6 温度对酯化反应的影响

反应温度是酶促反应中的一个重要的因子。反应温度对癸酸/甘油酯化反应的影响:在10～60℃之间,癸酸转化率变化比较大,温度比较低时,随温度升高其转化率也提高,50℃时其转化率达到最高,但40～50℃之间没有明显的变化,当反应温度超过50℃时,癸酸转化率急剧降低。对于吸热反应而言,高温使热力学平衡向产物方向移动,有利于产物产量的提高。本研究中,反应在有机溶剂体系中进行,不存在底物溶解性问题,反应体系的黏度问题也不存在。因此可以避免使用过高的反应温度。

2.7 产品组成分析

分析产品混合物的典型液相色谱发现,剩余游离癸酸物质的量比为18.31%,有81.69%的癸酸转化为MCG。在产品中癸酸甘油单酯、癸酸甘油二酯和癸酸甘油三酯的百分比分别为8.60%、35.18%和56.22%。结果表明,来源于C.rugosa的脂肪酶可被用于生产癸酸甘油二酯和癸酸甘油三酯。

3 结论

本文以来源于Candida rugosa的脂肪酶作为催化剂,进行了有机溶剂中酶促癸酸和甘油酯化合成中链甘油酯的研究。考察了酶量、底物比率、反应时间、有机溶剂和水分活度对反应的影响。结果表明最佳反应条件为:温度,40℃;时间,24 h;底物物质的量比2.5;酶量100 mg。反应中所用的有机溶剂对酶的催化活性有极大的影响,一般而言,在logP为3.5～4.0的非极性有机溶剂中,脂肪酶的催化活性比较高。在起始水分活度aw为0.33时,可以获得最大产物产率。对最终反应产物进行HPLC分析表明,来源于Candida rugosa的脂肪酶有利于癸酸甘油二酯和癸酸甘油三酯的催化合成,而癸酸甘油单酯的合成催化能力比较差。

[1］Krishna S H.Developments and trends in enzyme catalysis in nonconventional media[J].Biotechnology Advances,2002,20:239-267

[2］Oliviera J V,Oliviera D.Kinetics of the enzymatic alcoholysis of palm kernel oil in supercritical CO2[J].Int Eng Chem Res,2000,39(12):4450.

[3］MillerD A,Blanch H W,Prausnitz J M.Enzymatic interesterification of triglycerides in supercritical carbondioxide[J].AnalN YAcad Sci,1990,613:534.

TQ225.242

A

1003-3467(2010)18-0030-02

2010-07-21

李 论(1973-),男,工程师,主要从事技术管理工作,电话:13705238812。