异丙酚对急性脑损伤后神经细胞凋亡影响的研究进展

梁 敏,崔沛苓

(1.海南省人民医院麻醉科,海南 海口 570311;2.天津市天和医院,天津 300050)

急性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)后神经元损伤可分为两种形式,一种称为原发性神经元损伤,指损伤暴力对神经元的机械损伤,在创伤的同时发生。另一种称为迟发性神经元损伤,由多种因素引起,在创伤几小时、几天或更长时间后发生。经大量实验证实,这种迟发性损伤主要表现在神经元的程序性死亡即凋亡。TBI后神经元的凋亡涉及了许多病理生理变化[1],了解这些变化及机制对开展脑保护的研究具有重要意义。异丙酚(Propofol,Pro)是临床上常用的短效静脉麻醉药,近年来有文献报道,Pro的脑保护机制与抑制细胞凋亡(Cell apoptotic,CA)有关[2]。本文就 Pro对 TBI后神经 CA的研究进展综述如下:

1 TBI与细胞凋亡的关系

在过去的十多年间,一系列的动物模型及人脑组织标本的研究证实了脑外伤后 CA参与了继发性脑损伤的发展过程。1993年 Tominaga等[3]首次证实缺血性脑损伤可引起神经 CA,Rink等[4]1995年发现大鼠脑外伤后伤侧皮质、白质、海马、齿状回等区域出现 CA。Conti等[5]发现在脑外伤后 24 h和 1周有 2个凋亡高峰。Williams等[6]发现伤后 12个月,在白质内仍能见到明显的凋亡细胞。上述证据说明 CA参与了 TBI后神经细胞病理改变过程。

2 神经元凋亡的发病机制

2.1 兴奋性神经递质的释放 在局部脑缺血过程中,兴奋性氨基酸(Excitatory aminoacids,EAA)的神经毒性作用是损伤脑组织的启动者和执行者。该机制不仅直接导致细胞坏死,同时也可诱导 CA凋亡。

2.2 钙超载激活一系列钙依赖性酶促反应,促进了凋亡的发生。

2.3 脑缺血再灌注后产生大量氧自由基(Oxygen free radical,OFR)对神经细胞造成严重损伤的同时,也诱导了凋亡的发生。

2.4 缺血、缺氧、应激反应和其他损伤因素激活枯否氏细胞,其产生大量的细胞因子(Cytokine),如肿瘤坏死因子(TNF-α)在脑组织中高表达具有神经毒性。

2.5 凋亡相关基因 TBI后继发性损伤因素可导致神经细胞凋亡的发生。已有研究发现该凋亡过程受Bcl-2,Caspase,p53,以及死亡相关蛋白激酶(Death associated protein kinase,DAPK)等调控,凋亡对 TBI预后有重要的作用。通过主动对基因调控进行干预,抑制脑 CA,从而达到脑保护的作用。

2.5.1 Bcl-2 Bcl-2是重要的抗 CA基因,在缺血再灌注损伤中表现得尤为突出。其抗 CA作用机理有:①抑制 Ca2+的释放。②阻止促 CA基因信号传递或阻止这些诱导基因产物发挥作用。③抑制OFR。

2.5.2 p53 p53是调控 CA的基因。在正常细胞中 p53水平很低,但是在一定外界刺激下,如DNA损伤、脑血流量减少或缺血、缺氧等可引起细胞内的蛋白激酶(PKC)和 C-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)磷酸化而激活 p53。p53可以直接引起CA,也可以通过调节其他凋亡相关基因表达间接导致 CA。目前研究认为 p53是 Bcl-2的上游调节基因,Bcl-2基因启动子有 4个 p53结合位点,当 p53与之结合以后,下调 Bcl-2的表达,促进 CA。

2.5.3 Caspase家族 Caspase全称为门冬氨酸特异半胱氨酸蛋白酶,它通过介导和执行致死指令在缺血性的神经元凋亡过程中发挥重要作用。作为凋亡的中心执行者,正常状态下以无活性的结构存在,Caspase 3的激活将导致 DNA修复蛋白细胞骨架蛋白及其他 Caspase相关蛋白的裂解,在此过程中,Caspase家族成员形成一个蛋白级联反应,使细胞 DNA损伤,结果形成凋亡小体。

2.5.4 DAPK DAPK是一类新型的、由钙调节蛋白(Calmodulin,CaM)调节的丝氨酸/苏氨酸激酶(Protein serine/threonine kinase,PSTK)[7]。它是由 Adlkimchi及其同事在功能性基因克隆中首先发现的[8],现在已经确认,DAPK是一种参与 CA的正调控因子。DAPK可出现于脑缺血后神经元凋亡启动阶段信号转导级联反应定型之前[9]。正常状态下细胞内的 DAPK是没有活性的,当细胞受到各种死亡信号刺激后 DAPK去磷酸化被激活,通过 p53途径或非 p53途径以及引起膜空泡作用促 CA[10],其在 CA的信号转导途径中位于p53和 Caspase-3的上游[11]。最新的大鼠脑损伤模型的研究证实:脑损伤 8 h后 DAPKmRNA的表达开始增高并出现明显的神经元凋亡;二者在伤后 24 h达到高峰,证实药物治疗时间窗为伤后 24 h[12]。

3 Pro抑制神经细胞凋亡作用的研究

大量研究表明在缺血性或 TBI后存在的 CA在继发性损害中发挥相当重要的作用。一般认为,机械性脑损伤后中心区脑细胞缺血、坏死及血管损伤可造成半暗区神经元处于水肿及低灌注状态,如果在一定时间内得不到救治也会逐渐发展为程序性坏死。因此,在缺血性脑损伤中,通常所说的脑保护效应,主要是指对半暗区神经元的保护,以图打断病变发展进程,避免神经元的迟发性损伤,实验研究表明通过使用抗凋亡剂干预可使神经元复苏,从而抑制凋亡可能对保护神经元起到某种治疗作用。近来有文献报道,Pro的脑保护机制与抑制 CA有关。Engelhard[13]研究了 Pro对大鼠不完全性脑缺血 45 min所致海马神经元凋亡数目的影响,发现 Pro可以明显减少缺血后神经元损伤乃至凋亡。Kodaka[14]还发现 Pro可以减少缺血 7 d后海马锥体细胞迟发性神经元死亡,具有长期的脑保护效应。实验表明缺血 2 h再灌注 2 h时,出现神经细胞水肿坏死、凋亡等病理改变,缺血中心以坏死为主,缺血半暗带以凋亡为主,应用异丙酚组凋亡细胞明显减少,说明 Pro对中心区和半影区神经 CA有一定的抑制作用[15-16],抑制 CA的作用在再灌注后 6 h-3 d最明显[17]。

3.1 Pro抑制神经 CA脑保护作用的可能机制

3.1.1 Pro的抗氧化作用 TBI时涉及的病理生理机制复杂。脂质过氧化物的堆积和一氧化氮(NO)的爆发生成是其中的关键病理因素之一。TBI时大量产生的 NO和超氧阴离子生成的过氧亚硝酸阴离子是引起各种病理改变的重要因素。研究证实Pro可非选择性抑制 NO合成酶(NOS)的活性,降低神经系统 NO含量,直接清除 OFR,具有抗氧化作用[18-20]。其公认的机制是 Pro与内源性抗氧化剂 α-生育酚及已知的抗氧化剂丁化羟基甲苯在化学结构上相似,都含有一个苯酚基团,可直接与 OFR反应,生成 2,6—二异丙基苯氧基团,同时使 OFR灭活。

3.1.2 抑制中枢兴奋性神经递质的释放 N-甲基 -D-天门冬氨酸(NMDA)受体是一种 EAA受体,在大脑皮层和海马中密度最高。谷氨酸(Glutamate,Glu)作为中枢神经系统的 EAA递质,由神经末梢和激活突触后受体释放,在氧化应激如卒中、创伤等条件下,其细胞外浓度会增加,过量 Glu的兴奋性毒性会直接损伤神经元。同时 NMDA受体过度兴奋引起 Ca2+大量内流,导致细胞内钙超载,引起细胞损伤。高浓度 Pro可降低由 NMDA诱发的细胞内Ca2+升高,可能是其神经保护作用机制之一。Pro还可明显减少 EAA的释放,抑制 Glu受体磷酸化,减轻脑组织兴奋性损伤[21]。

3.1.3 预防钙超载 Pro还通过调节细胞内Ca2+平衡等[22]来起到抗凋亡的作用。目前认为钙介导的毒性作用是脑细胞死亡的重要因素。各种原因引起的细胞内钙超载是启动一系列病理生理机制导致神经细胞死亡和凋亡的最后共同通路。细胞内钙浓度往往和脑损伤时细胞受损程度呈正相关。Chang等[23]研究 Pro降血压机制时发现 Pro可抑制细胞外经电压依赖性钙通道流入的钙,该反应类似已知的钙通道阻滞剂维拉帕米,并表明 Pro可在一定程度上增加 L-型电压依赖性钙通道的电流失活率,从而减少钙内流。有研究认为 Pro还可通过抑制磷脂酶 C的活性进而抑制三磷酸肌醇的合成,使细胞内储存钙的释放减少,减轻细胞内钙超载[24]。此外,如前所述 OFR大量产生可导致脂质过氧化(LP)、细胞膜通透性增加、钙内流增多,从而使细胞内钙浓度升高,达到一定水平后又可通过多种途径产生更多的 OFR,形成恶性循环。Pro的抗氧化作用可以终止这一恶性循环,减轻细胞内钙超载。

3.1.4 调节凋亡相关蛋白的表达 研究表明Pro可以促进大鼠海马抗凋亡基因 Bcl-2的表达,减轻 Caspase-3活性使其表达显著减少。其可能机制可能与 Pro上调了 Bcl-2基因表达,拮抗细胞凋亡有关[25-26]。笔者最近观察了 Pro对大鼠脑创伤后DAPKmRNA的表达及凋亡的影响,证实TBI后 8 h大鼠脑创伤区 DAPK表达明显增高。Pro对脑损伤神经CA的保护作用可能与抑制 DAPK的表达有关[27]。

3.1.5 对细胞因子的影响 冯春生[28]在大鼠局灶性脑缺血模型中,于缺血前 10 min腹腔内注射Pro 100 mg◦kg-1,结果显示 IL-1和 TNF-α的表达峰值较对照组明显降低。说明 Pro可减轻 TNF-α介导的 CA。

3.1.6 p53 张玮玮等[29]利用大鼠肝脏缺血再灌注模型,观察肝脏缺血再灌注期 Bcl-2、p53蛋白的变化及 CA率,发现 Pro可以通过调节 Bcl-2、p53蛋白表达,使肝 CA减轻,从而对大鼠缺血再灌注肝脏有一定的保护作用 。

4 结 语

脑损伤并非是单一的病理生理过程,而是由众多复杂的生化级联反应构成。目前的研究显示,Pro可作用于神经元凋亡发病机制的多个位点,其脑保护机制是多途径多位点交互作用的结果。Pro对TBI后神经 CA的脑保护作用及其机制尚未完全阐明,值得今后进一步深入研究。

[1] Raghupathi Ramesh PhD.Cell mechanisms following traumatic brain injury[J].Brain Pathology,2004,14(2)∶215-222.

[2] Kodaka M,Mori T,Tanaka K,et al.Depressive effects of propofol on apoptotic injury and delayed neuronal death after forebrain ischemia in the rat comparison with nitrous oxideoxygen isoflurane[J].Masui,2000,49(2)∶130-138.

[3] Tominaga T,Kure S,Narisawa K,et al.Endonuclease activation following focal ischemic injury in the rat brain[J].Brain Res,1993,608(1)∶21-26.

[4] Rink A,Fung KM,Trojanowski JQ,et al.Evidence of apoptosis cell death after experimental traumatic brain injury in the rat[J].Am J Pathol,1995,147(6)∶1 575-1 583.

[5] Conti AC,Raghupathi R,Trojanowski JQ,et al.Experimental brain injury induces regionally distinct apoptosisduringthe acute and delayed post-traumatic period[J].J Neurosci,1998,18(15)∶5 663-5 672.

[6] Williams S,Raghupathi R,Mackinnon MA,et al.In situ DNA fragmentation occurs in white matter up to 12 months after head injury in man[J].Acta Neuropathol,2001,102(6)∶581-590.

[7] Miyshita T.Reed JC.Tumor suppressor p 53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene[J].Cell,1995,80(27)∶293-299.

[8] Sanjo H,Kawai T,Akira S,et al.DRAKs,novel serine/theonine kinases related to death-associated'protein kinase that trigger apoptosis[J].JBiol Chem,1998,273∶29 066-29 071.

[9]Schumacher AM,Velentza AV,Watterson DM,et al.Death-associated protein kinase as a potential therapeutic target.Expert Opin[J].The Targets,2002,6∶497-506.

[10]Shani G,Marash L,Gozuacik D,et al.Death-associated protein kinase phosphorylates ZIP kinase,forming a unique kinase hierarchy to activate its cell death functions[J].Mol Cell Biol,2004,24∶8 611-8 626.

[11]梁 敏,王宇田.调节神经元凋亡信号转导途径的关键酶:死亡相关蛋白激酶[J].中国危重病急救医学,2005,17(5):318-319.

[12]李 艳,梁 敏,陈 勇,等.创伤性脑损伤后大鼠脑神经元凋亡和脑死亡相关蛋白激酶的表达变化[J].中国医师杂志,2009,11(1)∶34-36.

[13]Engelhard K,Werner C,Eberspacher E,et al.Influence of propofol on neuronal damage and apoptotic factors after incomplete cerebral ischemia and reperfusion in rat s:a long-term observation[J].Anesthesiology,2004,101(4)∶912-917.

[14]Kodaka M,Mori T,Tanaka K,et al.Depressive effect s of propofol on apoptotic injury and delayed neuronal death after forebrain ischemia in the rat comparison wit h nitrous oxideoxygen isoflurane[J].Masui,2000,49(2)∶130-138.

[15]刘鹏斌,蔡英敏,宋金鑫.异丙酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响[J].第四军医大学学报,2007,28(8)∶682-684.

[16]杨宾侠,王永利,赵砚丽.异丙酚对大鼠局灶性脑缺血/再灌注后细胞凋亡的影响[J].中华麻醉学杂志,2003,23(5)∶288-290.

[17]陈莲华,薛张纲,蒋 豪.异丙酚对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑细胞凋亡经时反应进程的影响[J].中华麻醉学杂志,2005,25(10)∶765-767.

[18]梁 敏,魏小斌.丙泊酚对急性颅脑损伤患者体内活性氧的清除作用[J].中国医师杂志,2005,7(4)∶436-438.

[19]梁 敏,魏小斌,林赛娟.异丙酚对急性颅脑损伤患者血内一氧化氮及相关因子含量的影响[J].中华急诊医学杂志,2002,11(2)∶84-85.

[20]Wilson JX,Gelb AW.Free radicals,antioxidants,and neurologic injury:possible relationship to cerebral protection by anesthetics[J].JNeurosurg Anesthesiol,2002,14(1)∶66-79.

[21]Snyder GL,Galdi S,Hendrick JP,et al.General anesthetics selectively modulate glutamatergic and dopaminergic signaling via site specific phosphorylation in vivo[J].Neuropharmacology,2007,53(5)∶619-630.

[22]曹江北,李云峰,米卫东,等.丙泊酚对细胞内钙离子的调节[J].国外医学药学分册,2002,29(4)∶293-296.

[23]Chang KSK,Davis RF.Propofol producesendothelium independent vasodilation and may act as a Ca2+channel blocker[J].Anesth Analg,1993,76(1)∶24-32.

[24]TsujiguchiN,YamakageM,NamikiA.Mechanisms of direct inhibitory action of propofol on uterine smooth muscle contraction in pregnant rats[J].Anesthesiology,2001,95(5)∶1 245-1 255.

[25]戚思华,韩宝庆,李文志,等.异丙酚对大鼠前脑缺血/再灌注后海马 Bcl-2表达的影响[J].国际麻醉学与复苏杂志,2006,27(3)∶193-196.

[26]Acquaviva R,Campisi A,Raciti G,et al.Propofol inhibits caspase-3 in astroglial cells:role of heme oxygenase-1[J].Curr Neurovasc Res,2005,2(2)∶141-148.

[27]梁 敏,李 艳,王宇田.异丙酚对大鼠脑创伤后神经细胞凋亡及 DAPKmRNA表达的影响[J].中华麻醉学杂志,2009,29(7)∶652-654.

[28]冯春生,麻海春,岳 云,等.异丙酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注时核因子 κB的活化和炎症因子表达的影响[J].中华医学杂志,2004,84(24)∶2 110-2 114.

[29]张玮玮,郭永清.丙泊酚对大鼠肝脏缺血再灌注损伤 Bcl-2和P53表达的影响[J].山西医药杂志,2008,37(10)∶892-894.