传染性支气管炎病毒结构蛋白研究进展*

宋翥远,卿上田,肖朝庭,黎满香*

(1.湖南农业大学动物医学院,湖南长沙410128;2.湖南省兽医总站,湖南长沙410007)

鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病[1],主要以张口呼吸、咳嗽、气管啰音、腺胃肿大、出血、“花斑肾”为主要特征。自1931年Schalk A F等[2]首次报道了经典的呼吸型禽传染性支气管炎(IB)并确定为病毒性疾病以来,已有肠型、腺胃型、肾型等多种病型相继报道。IBV与大多数RNA病毒一样,在宿主细胞浆内增殖,在病毒基因RNA转录过程中,形成5种较短的信使RNA(由大到小分别命名为mRNA6、5、4、3、2),其中mRNA2、mRNA3、mRNA4、mRNA6分别编码IBV的4个结构蛋白S(Spike,S)、E(Envelope,E)、M(Membrane,M)、N(Nucleocapsid,N)。按照蛋白的排列顺序,依次对其进行概述。

1 S蛋白

S蛋白是一个高度糖基化的糖蛋白,有21～28个N连接的糖基化位点[3]。它包括4个结构域,即信号肽序列、外功能区、跨膜区、胞内区[4]。S蛋白被酶解为氨基端S1和羧基端S2两亚基,其中S1由约535个氨基酸组成(约90 ku),包含S蛋白的受体结合活性区域,缺失S1蛋白的IBV不能诱导产生病毒中和和血凝抑制抗体,S1与病毒的组织嗜性有关;S2由约627氨基酸组成(约84 ku),包含S蛋白的跨膜区和胞内区,与S1非共价结合[5]。S蛋白上有重要的病毒抗原决定簇,基因突变会影响病毒的致病性[6]。报道称在S蛋白的羧基端含有一由双碱性氨基酸(-KKXX-COOH)组成的内质网定位信号(retrieval signal,ER),具有把新合成的S蛋白定位在内质网-高尔基中间体上的作用[7]。但Youn S等[3]则通过构建缺失S蛋白胞质尾区中内质网定位信号和双酪氨酸内吞作用信号(endocytosis signal)的IBV,感染性克隆发现内吞作用信号时病毒有效感染所必需的,但缺失内质网定位信号的病毒则具有活力。而S1亚基中294氨基酸Q突变为L导致S蛋白成熟和加工受阻,且S蛋白不能融合到病毒粒子中去。Xiao H等[8]采用双酵母双杂交系统、免疫共沉淀和免疫荧光方法发现SARS-COV和IBV的S蛋白N端与真核起动子3相互作用,通过它影响宿主细胞基因,尤其是与病毒感染周期中相关基因的表达。通过荧光染色等检测方法,证明在胞质尾区中的酪氨酸1143是S蛋白的重要组成部分[9]。大量的研究认为,IBV的变异部位主要在S1基因区。Kusters J G等[10]比较了4个不同血清型的IBV毒株的S1基因氨基酸序列后发现,在545个S1氨基酸残基中,只有243个是保守的,尤其是在50位～170位和50位～310位的氨基酸残基发生替代的机率较大,而且120位～170位氨基酸残基的插入或缺失的现象更是常见,其中的两个高变区(hypervariable region,HVR),HVR1(56-59)和HVR2(117-133)和中和表位有关。Sapats S I等[11]比较了澳大利亚1962年—1991年间分离株的S1基因,发现S1基因长度发生了变化,发生插入或缺失主要位于59位～313位,而氨基酸差异主要位于53位～152位,192位～202位和288位～313位处。比较有毒力的嗜肾型Gray株与无毒力的JMK株发现,氨基酸残基123位～152位之间的变异可能是导致两者致病性不同的关键。

2 E蛋白

该蛋白的大部分嵌入在囊膜中,由Mrna3的ORF3c编码,分子质量约为12.4 ku。在病毒粒子的组装与出芽中具有重要作用,它的近氨基端具有锚定E蛋白的跨膜结构,胞质尾区具有高尔基靶向信号,羧基端含有一个“RDKLYS”的内质网定位信号,若把倒数第4位的赖氨酸突变为谷氨酰胺则导致E蛋白在高尔基体中大量积聚,另外,位于N端的第3个跨膜结构域在病毒的出芽中起着关键作用,敲除该区导致病毒组装失败,E蛋白胞质尾区是与M蛋白相互作用的区域[12]。它使M蛋白与E蛋白定位在相同的细胞器而利于形成E和M蛋白复合体,因而使M蛋白组装进入病毒包膜中;如果这一区域缺失将导致病毒粒子复制大量减少[13]。但是Marta L D等在研究缺乏E蛋白的SARS重组病毒中发现,E蛋白不是病毒复制必需的,不过它影响病毒生长,它的缺失使病毒的复制滴度较野生型感染性克隆低100倍以上[14]。说明E蛋白在不同的冠状病毒之间存在功能差异。

3 M蛋白

M蛋白是由221个氨基酸组成的三次跨膜N糖蛋白,与S蛋白结合,被认为是冠状病毒组装过程中的一个关键信号。它是病毒粒子的重要组成部分,并且在病毒的装配、出芽和成熟过程中起到了重要的作用。M蛋白是IBV粒子中含量最高的糖蛋白,约占病毒总蛋白的40%,M蛋白聚集于粗面内质网和高尔基体膜中,与E蛋白、β-Actin相互作用,具有控制并介导病毒粒子从粗面内质网膜或高尔基体膜出芽的作用,同时,在病毒装配时还与核衣壳蛋白(N)相互作用,并有将核衣壳蛋白结合到囊膜上的作用[15]。M蛋白的靶向信号位于它的第一个跨膜区而不同于E蛋白的胞质尾区,共表达M和E蛋白能够形成病毒粒子[12]。M蛋白中A159和K160人工突变导致IBV的感染性丧失[15]。

4 N蛋白

N蛋白是冠状病毒的主要结构蛋白之一,由377个至455个氨基酸组成,特征为具有高等电点、高丝氨酸含量,是一种多功能的磷酸化蛋白,在感染细胞中,是表达量最高的病毒蛋白之一。N蛋白在病毒的复制和转录中起作用,而且具有很好的免疫原性,可在体内产生高水平的抗体并介导细胞毒性T细胞效应[16]。N蛋白具有RNA结合位点,参与病毒RNA的合成,含有核定位和核输出信号调节胞质与胞核动态运输过程。Spencer K A等[17]采用圆二色性和核磁共振的方法在研究IBV N蛋白和病毒RNA的关系中发现,N蛋白和病毒RNA之间主要是静电吸引作用,N蛋白氨基端与病毒RNA之间有大范围的非特异相互作用,使得病毒RNA与N蛋白以一种“引诱-锁定”的方式特异结合。进一步研究发现IBV N蛋白两个保守磷酸化区域之中的近C端磷酸化区域与识别病毒RNA或非病毒RNA有关,而且在IBV的拯救中,辅助表达磷酸化N蛋白的拯救成功率大大高于非磷酸化或半磷酸化N蛋白。N蛋白的磷酸化形式对IBV的生物学有着重要的作用[18]。在N蛋白的输出机制方面,Reed M L等[19]研究了IBV感染的VeroV和DF-1细胞,发现在N蛋白羧基端的一个富含亮氨酸的八肽(291-LQLDGLHL-298)起着核输出信号的作用,通过氨基酸替代和缺乏证实Leu296和Leu298是N蛋白从核中有效输出所必需的,另采用来普霉素B阻断发现该过程是一个不依赖可溶解性受体exportin 1的过程,不同于多数的核输出信号所采用的机制。

5 结语

目前发现,IBV至少有30种以上的血清型,不同的血清型或毒株之间交叉保护性弱,主要原因是由于IBV结构性蛋白不稳定造成的。以前传染性支气管炎病毒主要致力于S蛋白的研究,认为S蛋白在进化上比M蛋白、N蛋白、E蛋白都要活跃。但是近几年来发现,N蛋白在病毒进化过程中也起到了至关重要的作用。综上所述,通过IBV结构蛋白的结构和生物学功能的研究,为研究传染性支气管炎的一些基本生命过程和规律提供新的思路,并对该病毒的防控具有重要意义,可为传染性支气管炎的预防与控制寻找新的途径。

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