禽流感病毒致病性的分子基础研究进展*

杨彩然,董淑珍,杨宗泽,倪 静

(河北科技师范学院动物科学系河北省预防兽医学重点实验室,河北昌黎066600)

禽流感病毒属正黏病毒科,A型流感病毒属。A型流感病毒感染范围广,常以流行形式出现,表现为发病急剧,蔓延迅速,人和动物都能感染,危害极大。流感病毒是分节段的负链RNA病毒,由8个基因片段组成,分别编码碱性聚合酶1(basic polymerase 1,PBl)、碱性聚合酶2(basic polymerase 2,PB2)、酸性聚合酶(acidic polymerase,PA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)、血凝素(hemagglutinin,HA)、基质蛋白1(matrix protein 1,M1)、基质蛋白2(matrix protein 2,M2)、非结构蛋白1(non-structural protein 1,NSl)、非结构蛋白2(non-structural protein 2,NS2)、核蛋白(nucleoprotein,Np)和PB1-F2蛋白等11个蛋白。论文就禽流感病毒的致病性研究进展,从病毒基因编码的蛋白方面逐一阐述其致病的分子基础。

1 血凝素(HA)与禽流感病毒致病性的关系

流感病毒感染的第一步是病毒吸附于细胞膜上,然后HA经过蛋白酶切割裂解为HA1和HA2两个亚单位,才具有感染性,HA的裂解性由以下两个结构特征决定。

1.1 HA裂解位点处的氨基酸序列决定H5和H7亚型禽流感病毒的致病力

HA对宿主蛋白酶敏感性的主要结构特点是在HA0上连接HA1和HA2的外部圈处的蛋白酶解位点的成分。Senne D A等比较了H5和H7亚型低致病力禽流感病毒(low pathogenic Avian influenza virus,LPAIV)和高致病力禽流感病毒(highly pathogenic Avian influenza virus,HPAIV)的HA氨基酸序列,发现二者在HA裂解位点处的氨基酸序列不同,通常LPAIV的HA裂解位点处只有单个的碱性氨基酸,只能在呼吸道、消化道等少数细胞中裂解,因此,造成温和感染或不表现临床症状,而HPAIV的HA裂解位点处有多个连续的碱性氨基酸插入,在无类胰蛋白酶的情况下就能发生裂解,可以在宿主的很多不同细胞中裂解为HA1和HA2,造成感染禽全身系统衰竭,导致死亡。近年来研究发现,HA裂解位点处氨基酸在不断进化,唐应华等发现对鸡均为高致病力,而对麻鸭具有不同致病力的两个毒株A/mallard/Huadong/S/2005(简称S病毒)和A/mallard/Huadong/Y/2003(简称Y病毒)的HA裂解位点处氨基酸不同,前者的HA基因在322位是亮氨酸(L),329位氨基酸缺失;而后者的HA基因在322位是谷氨酰胺(Q),329位是赖氨酸(K)。S病毒对麻鸭致病力高,Y病毒对麻鸭无致病力。通过反向遗传操作进一步研究发现,S病毒和Y病毒HA基因裂解位点区322位和329位氨基酸残基突变或缺失均影响病毒对麻鸭的致病力,HA基因的L322位,329位氨基酸缺失,是S病毒和Y病毒的毒力决定因子[1]。

1.2 HA裂解位点和受体结合位点附近的糖链的变化

HA裂解位点附近的糖链可干扰蛋白酶到达裂解位点,当罩着的糖链丢失后,可提高HA对蛋白酶的敏感性,去除1997年H5N1高致病力流感病毒154位糖链,可增加病毒的毒力。受体结合位点附近增加糖链,可影响病毒的致病力[2]。

1.3 特殊氨基酸的作用

Govorkova E A等[3]研究了2004年分离株禽流感病毒对雪貂的致病力,发现尽管所有毒株的HA裂解位点都有多个碱性氨基酸的插入,但是各毒株的毒力不同,说明除裂解位点处的氨基酸外,HA的其它位置氨基酸对病毒的致病力也有一定影响。Diane J H等[4]用反向基因操作技术,研究H5N1亚型禽流感病毒表面蛋白的致病力,改变高致病力毒株A/Chicken/Hong kong/YU562/01和中等毒力毒株A/Goose/Hong kong/437-10/99及其重组毒株的HA的第97、108、126、138、212、217、338位氨基酸,发现HA的97,108,126,138位氨基酸的变化,可使高致病力禽流感病毒的致病力下降;而对中等致病力毒株的HA上述位置的氨基酸替换后,病毒致病力增强。另外,改变高致病力和中等致病力病毒HA的212、217位氨基酸均可使病毒的致病作用增强。进一步分析这些氨基酸能显著影响病毒致病力的原因,发现126位氨基酸在唾液酸结合位点附近,而且还接近中和表位。138位氨基酸在抗原位点140 S圈内,是一个抗原位点[5]。217位氨基酸接近受体结合位点,此氨基酸的改变可提高受体结合效率,有利于病毒复制,提高其致病力[4]。

2 神经氨酸酶与禽流感病毒致病性的关系

对于高致病性禽流感H5和H7亚型病毒而言,其NA茎部的氨基酸丢失与其毒力呈相关关系。Yumiko M等[6]通过分析1996年到2007年期间分离自多种禽类的H5N1亚型禽流感病毒的NA基因发现,大部分禽流感病毒的NA基因颈部长度变短,并且拥有短颈NA的病毒对小鼠的致病力增强。

低致病性禽流感病毒NA茎部的氨基酸的改变与病毒毒力的关系,表现出与高致病性禽流感病毒相同的特性。Egbert M等[7]通过对低致病性禽流感病毒(H5N1,H5N2,H5N3)的研究发现,H5N2,H5N3亚型病毒在鸡体内复制能力增强,并且引起多器官的组织发生病理变化,而H5N1亚型病毒则没有引起上述变化。经序列分析发现,H5N2,H5N3亚型病毒在鸡体内复制后,其NA茎部缺失20个氨基酸,H5N1病毒NA茎部则未发生改变。

3 多聚酶复合物与禽流感病毒致病性的关系

3.1 PB2蛋白的627位、701位和714位氨基酸突变,可改变病毒的毒力

研究证明,H5N1亚型流感病毒的PB2蛋白627位用赖氨酸取代谷氨酸后,可增加多聚酶的活性,进而提高病毒在哺乳动物细胞的复制效率[8-9]。

PB2蛋白的701位氨基酸与病毒毒力有关。Li Z等[10]用分离于健康鸭的两株H5N1亚型病毒A/Duck/Guangxi/22/2001(DKGX/22)和A/Duck/Guangxi/35/2001(DKGX/35)对鼠进行致病性试验研究表明,DKGX/22对小鼠没有致病力,而DKGX/35对小鼠表现出高致病力。采用反向遗传方法进一步研究,发现DKGX/22的PA、PB2、NA和NS基因能致弱DKGX/35病毒,但PB2起决定作用,毒株DKGX/22的PB2的第701位氨基酸对病毒毒力起重要作用,当突变701位氨基酸(天冬酰胺取代天冬氨酸)后,DKGX/22可致死小鼠。PB2的另一个氨基酸——精氨酸(R714)能提高多聚酶的活性,对病毒毒力也有一定影响。

3.2 PA和PB1蛋白的氨基酸突变,可改变病毒的毒力

多聚酶中,除了PB2之外,PA和PB1也与病毒毒力有关[11]。Hulse-Post D J等[12]研究发现,当病毒的PA第515位氨基酸由苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)时,使病毒对鸭的致病力减退,但仍保持对雪貂和小鼠的高致病力,这表明病毒致病力不仅与氨基酸的改变相关,还与宿主种类有关。研究发现,从野禽中分离到的低致病力H5N2亚型禽流感病毒A/Aquatic bird/Korea/W81/05(W81)在小鼠体内连续传代后,病毒对小鼠具有了高致病力,进行反向遗传研究表明,PA在病毒的致病力方面起重要作用,当病毒的PA第97位氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸(I)时,对小鼠的致病力增强[13]。

另外,通过PB1的436位酪氨酸(Y)被组氨酸(H)取代后,可使病毒毒力降低。值得注意的是,在自然感染途径下,PA(T515A)和PB1(Y436H)氨基酸的突变,可减少对鸭的致病力,而静脉注射两者依然能杀死鸭,说明病毒致病力还与组织嗜性有关。

3.3 PB2、PB1和PA多个氨基酸的变化与病毒致病力有关

通过比较1918年的流感毒株和随后的人流感病毒多聚酶基因和鸟类毒株的多聚酶基因发现,共有10个氨基酸发生了改变(PB2 199A1a→Ser、PB2 475Leu→Met、PB2 567Asp→Asn、PB2 627Glu→Lys、PB1 375Asn/T hr→Ser、PA 55Asp→Asn、PA 100Val→Ala、PA 382G1u→Asp、PA 552Thr→Ser)。值得注意的是在目前流行的H5N1亚型毒株中也发现了其中的一些变异,说明这些变异有利于病毒在人类细胞的复制,能增强致病力[14]。

4 基质蛋白

一些研究表明,流感病毒的M1蛋白的C末端域经修饰后方可感染小鼠[15-16]。M1蛋白的N末端和中间结构域的变异与病毒在鼠肺的复制有关。Fan S等[17]研究表明,禽流感病毒H5N1亚型的M1蛋白第30位天冬氨酸和215位丙氨酸的累加效应是对小鼠高致病力所必需,M1蛋白第30位天冬氨酸和215位丙氨酸正是处于M1蛋白N末端和C末端。

5 非结构蛋白与禽流感病毒致病性的关系

5.1 通过NS基因的替换研究,病毒的毒力发生改变

Li Z等[18]利用反向基因操作技术对从鹅体内分离到的对SPF鸡具高致病性H5N1亚型流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(GS/GD/1/96)及另一株对SPF鸡无致病性的H5N1亚型病毒A/Goose/Guangdong/2/96(GS/GD/2/96)的NS基因片段进行单基因替换,测定救获的病毒在SPF鸡体内的静脉内致病指数,发现病毒的NS基因在病毒的致病性方面起着关键的作用。当GS/GD/1/96的NS基因被GS/GD/2/96相应基因替换后,救获的病毒R-GS/GD/1-2NS的静脉内致病指数由2.1降低到0,反之,当GS/GD/2/96的NS基因被GS/GD/1/96相应基因替换后,救获的病毒R-GS/GD/2-1NS的静脉内致病指数由0升高到1.0。用救获的病毒R-GS/GD/1/96和R-GS/GD/1-2NS进行动物试验,通过鼻腔感染4周龄SPF鸡后,这两株病毒表现出完全不同的致病能力,R-GS/GD/1/96病毒在鸡体内复制能力很强,感染后3 d、6 d,各组织脏器均可发现大量的病毒抗原,感染鸡的各组织脏器均发现严重的病理损伤,对鸡的致死率为100%;而R-GS/GD/1-2NS病毒在感染鸡体内只引起肺间质少量淋巴细胞浸润,对鸡的致死率为0,进一步证实了NS基因决定H5N1亚型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96对SPF鸡的致病能力。

5.2 NS1蛋白的单个氨基酸突变、截短和删除,使病毒毒力发生变化

Li Z通过比较两个致病性不同的毒株GS/GD/1/96与GS/GD/2/96的NS1基因发现,二者只有149位氨基酸存在差异,并发现NS1基因的第149位为丙氨酸时可抑制鸡胚成纤维细胞中Ⅰ型干扰素(interferon,IFN)的产生[19]。

NS1的42位氨基酸是对病毒的致病作用的又一重要的氨基酸,H5N1亚型禽流感病毒的NS1蛋白第42位脯氨酸(P)被丝基酸(S)代替后,可极大地增加病毒对小鼠的致病力。进一步研究发现H5N1亚型禽流感病毒的NS1蛋白的42位丝氨酸是颉颃宿主细胞产生干扰素的关键因素,其通过抑制双链RNA介导的核转录因子к B(nuclear factor-κ B,NF-к B)反应、抑制干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF-3)依赖的启动基因的激活及抑制IFN的前mRNAs 3′末端的加工过程而发挥作用。通过研究还发现,在病毒DK/27的NS1蛋白的38位精氨酸(R)或K41位的两个氨基酸中至少有1个为碱性氨基酸时,NS1对小鼠有致病性[19],NS1蛋白的R38位和K41位氨基酸位于RNA结合域,其可抑制IFN的产生而使流感病毒呈现出毒性作用[20]。

William G D等[21]对1999年到2000年期间流行在意大利北部分离自禽类的40株H7亚型流感病毒(包括22株低致病力病毒和18株高致病力病毒)的NS1基因进行序列分析,研究发现,NS1基因有两个不同程度的C末端截短,其中16个毒株的NS1蛋白是由230个氨基酸构成,没有发生变化,有6个毒株的NS1被截短,剩下220个氨基酸NS1蛋白,其余18个毒株的NS1蛋白C末端序列的中间被截断,剩下224个氨基酸。而这18个毒株均为高致病力毒株。分离自H7N1流行初期的低致病力毒株的NS1蛋白没有截断发生。分离自H7N1流行后期的低致病力毒株的NS1蛋白则发生了截断。

龙进学等[22]通过比较41株H5N1亚型AIV的NS序列发现,共有22株均在NS1的263位～277位核苷酸处发生了缺失,而且此22株均是2000年后的分离株。采用反向遗传方法,用救获的重组病毒对鸡进行致病性试验,结果表明,NS第263位～277位核苷酸缺失的重组病毒提高了病毒对鸡的致病力。

5.3 NS1蛋白C末端的4个氨基酸残基影响病毒毒力

Obenauer J C等[23]对从野鸟和家禽中分离出的大量H5N1亚型病毒的基因序列进行分析,发现多数H5N1亚型禽流感病毒的NS1蛋白的C末端包含谷氨酸-丝氨酸-谷氨酸-缬氨酸(ESEV)的氨基酸序列,这些残基能与带有PDZ位点的蛋白质结合,而含有PDZ位点的许多蛋白质,在许多关键的信号转导途径(包括调节细胞膜蛋白的活动与运输功能,以及维持细胞的极性和形态等)中起重要作用。体外研究表明,H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白的C末端氨基酸序列易与人的PDZ域结合,中断含有PDZ的蛋白质参与细胞合成的重要过程,因而使H5N1亚型禽流感病毒的NS1蛋白呈现一定毒性[24]。

6 核蛋白与禽流感病毒致病性的关系

流感病毒的NP第184位丙氨酸被赖氨酸取代后,可增加病毒对鸡的致病性。而NP的184位氨基酸恰巧位于几个带正电荷氨基酸组成的RNA结合袋状区域内,当184氨基酸突变为赖氨酸时,其带正电荷,能与带负电荷的RNA结合,使病毒更有效地复制,破坏鸡的免疫系统,从而增加其致病性[25]。

7 结语

流感病毒的致病力是多因素相互作用的结果,其不仅和病毒本身有关,而且宿主因素也很重要。在病毒因素中,病毒的多个基因共同作用,其中多聚酶基因、NS基因和HA基因起主要作用,但这些基因间及基因与宿主间的关系很复杂,有待进一步深入研究。

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