siRNA干扰Chk1抑制人胃癌BGC823细胞增殖的实验研究

凌晖 朱亚平 刘芳 李艳兰 文玲 苏琦

南华大学肿瘤研究所，病理学教研室，湖南 衡阳 421001

生物体内存在复杂的细胞周期检测点信号网络途径，由感受器（Rad9-Rad1-Hus1复合体、Rad17等）、信号传导通路和效应器［细胞周期检测点激酶（checkpoint kinase，Chk，如Chk1、Chk2等）］等构成［1］。Chk1是生物进化过程中非常保守的一种蛋白激酶，在细胞周期检测点调节中有着非常重要的作用，其在人体多种正常组织和肿瘤组织中均有表达，并可能与某些肿瘤的发生发展有关［2］。研究表明，Chk1缺失的肿瘤细胞表现出多重缺陷如：细胞增殖缓慢、细胞周期检测点的阻滞反应消失和对DNA损伤剂的敏感性增加等［3-4］。由于细胞周期与肿瘤间的密切关系，Chk1与肿瘤的关系及其在肿瘤发生、发展和治疗中的作用也成为目前研究的热点之一。为探索Chk1在人类肿瘤细胞中对生长增殖活性和细胞周期的调控作用，本研究通过RNA干扰技术将人胃癌BGC823细胞中的Chk1基因沉默，阻断细胞周期检查点信号传导通路，观察其对人胃癌BGC823细胞生长及周期的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂 RPMI 1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自Hyclone公司。siRNA转染试剂、siRNA转染培养液及Chk1 siRNA（基因序列为5’-AAGTTCAACTTGCTGTGAATA-3’）、LipofectamineTM2000为Santa Cruz公司产品。Bradford试剂购于上海生功生物工程有限公司。Chk1（兔抗人多克隆抗体）及相应二抗均为Santa Cruz公司产品。β-actin购自武汉博士德公司（兔抗人多克隆抗体）。电化学发光剂Lumi-GLO Reagant是CST公司产品。碘化丙啶（PI）购自Sigma公司。

1.2 BGC823细胞的培养 人胃癌BGC823细胞株，购自中国科学院上海细胞研究所，系人胃低分化腺癌。常规培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37 ℃、CO2体积分数为5%、恒湿、恒温的培养箱中培养。

1.3 RNA干扰实验 siRNA的配制及脂质体复合体合成：5 nmol的Chk1 siRNA用无核酸酶水稀释，终浓度为20 μmol/L。将干扰用的适量siRNA稀释于siRNA转染培养液中，轻轻混匀。适量的LipofectamineTM2000与稀释的siRNAs混合，轻轻混匀，并于室温下温育20 min左右，制备获得siRNA-LipofectamineTM2000复合体。

siRNA转染细胞：转染前1 d将对数生长期的细胞以3×105个/孔接种于6孔板中，细胞铺板在2 mL含血清、不含抗生素的正常培养基中，于24 h内当细胞融合达40%～60%时进行转染，在加入复合物前换用1 mL无血清、无抗生素的培养液后将脂质体复合体加到培养板中，按转染试剂说明书分别予50、100、150 μmol/L的Chk1 siRNA进行转染。置37 ℃，CO2体积分数为5%的培养箱中培养6 h，吸弃培养液，加入新鲜的含血清、不含抗生素的正常培养液2.5 mL，实验分为未转染组、脂质体组和转染组3组，其中未转染组和脂质体组作为对照。

1.4 Western blot检测 细胞裂解，收集蛋白质，Bradford法测定含量。蛋白变性后每孔上样30 μg，经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转移至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的TBST（Tris-HCL 20 mmol/L，NaCl 137 mmol/L和0.1%Tween-20）室温封闭1 h，用Chk1、β-actin 4 ℃过夜，TBST洗3次，每次5 min，加入相应的二抗室温温育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，化学发光剂检测蛋白质印迹，薄层色谱扫描仪（日本公司生产，型号CS-930）测定印迹区带的灰度值。

1.5 MTT实验 MTT全称为3-(4,5)-dimethylthi ahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（formazan），甲臜的多少可以用酶标仪在570 nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度A值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT不会有反应。本实验常规胰酶消化后收集转染48 h后的细胞，制成单细胞悬液，细胞密度为1×105个，接种100 μL于96孔平底培养板，继续培养72 h。然后加入20 μL 5 mg/mL MTT/PBS液培养6 h即终止培养，以DMSO溶解甲簪，振摇10 min，置酶联免疫检测仪测定波长570处的A值（取6复孔）。抑制率（inhibition rate，IR）按公式计算： IR（%）=（1-A570实验组/A570对照组）×100%

1.6 流式细胞仪分析 收集转染24和48 h的培养细胞，用预冷的PBS洗涤2次，再用4 ℃预冷的75%乙醇溶液固定48 h，1 000×g离心10 min，弃上清液，1 000 μL PBS重悬加0.5 mg/mL RNase50 μL，混匀，37 ℃水浴30 min，PBS洗去RNase，100 μL PBS重悬，加1 mg/mL碘化丙啶（PI）50 μL，振荡混匀，4 ℃避光染色30 min。流式细胞仪测定荧光强度，CellQuest分析软件进行细胞周期DNA含量分析，确定细胞周期分布。

1.7 统计处理 采用SPSS 11.5.2.1统计分析软件，进行Student’s t-test法分析，数值用表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Chk1 siRNA转染后Chk1在BGC823细胞的表达 Western blot测结果显示（图1），转染靶向Chk1 siRNA 24 h的Chk1蛋白杂交带，其相对灰度值为0.11±0.08，明显低于未转染组的0.66±0.21、脂质体转染组的0.70±0.25（P<0.05），而未转染对照组与脂质体转染组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。Chk1的蛋白表达下调了83.1%。这证实了转染靶向Chk1 siRNA抑制Chk1蛋白的表达。

2.2 Chk1siRNA转染后对细胞增殖的影响在确保Chk1基因被有效沉默后，本研究针对Chk1蛋白表达缺失情况下的细胞，采取MTT法检测其增殖活性的变化。对siChk1转染48 h的BGC823细胞进行MTT 检测。相比未转染组和脂质体转染组，Chk1基因沉默后的BGC823细胞增殖活性明显下降，生长受到抑制。细胞增殖活性在100 μmol/L转染后48 h 其吸光度（A570）为0.41±0.04，明显低于为未转染组的0.79±0.05和脂质体转染组的0.82±0.07（P<0.05）（表1）。50 μmol/L siChk1对细胞生长有一定抑制作用，随浓度增加抑制率也增加，100 μmol/L时抑制率为48.1%，100、150 μmol/L浓度组对细胞的抑制率无明显差异。这些发现揭示一定水平的Chk1蛋白的表达是肿瘤细胞进行增殖活动所必需的。

表1 100 μmol/L siChk1转染后BGC823细胞48 h的A570 值Tab.1 The A570 values of BGC823 cells after siChk1 transfection within 48 h( , n=6)

表1 100 μmol/L siChk1转染后BGC823细胞48 h的A570 值Tab.1 The A570 values of BGC823 cells after siChk1 transfection within 48 h( , n=6)

*: P＜0.05 vs untransfected control.

2.3 Chk1siRNA转染后对细胞周期的影响 为了进一步探讨这种细胞生长变缓是否与细胞周期的改变有关，本研究采用了流式细胞仪（flow cytometry，FCM）的方法，检测了Chk1 siRNA转染后细胞处于不同时期的比例变化，对siChk1转染24、48 h后的细胞进行细胞周期分析，与未转染组相比，经过Chk1 siRNA作用后细胞比例在G0/G1期由未转染组的（48.3±1.1）%、（50.2±1.9）%增加至（63.9±1.7）%、（66.1±2.3）%（P<0.05），S期和G2/M期减少，增殖指数（proliferating index，PI）由51.7%和49.8%减少至36.2%和34.4%（表2，图2）。

图1 Chk1 SiRNA转染BGC823细胞后Chk1蛋白表达的改变Fig.1 Expressions of Chk1 protein in BGC823 cells after transfection with Chk1 siRNA

图2 Chk1 siRNA干扰对BGC823细胞周期的影响Fig.2 The effect of Chk1 gene silence on the cell cycle percentage of BGC823 cells

表2 Chk1 siRNA干扰前后BGC823细胞周期的变化Tab.2 Effect of Chk1 gene silence on the cell cycle percentage of BGC823 cells( , n=6)

表2 Chk1 siRNA干扰前后BGC823细胞周期的变化Tab.2 Effect of Chk1 gene silence on the cell cycle percentage of BGC823 cells( , n=6)

*: P＜0.05 vs untransfected group.

3 讨 论

肿瘤发生的根本原因在于本应停止增殖或生理性凋亡的细胞不停地进入细胞周期，从而导致细胞的恶性增殖。细胞通过调控cyclin、CDK、CKI和Chk1等基因的有序表达实现对细胞周期进展速度的调控［5］。检查点激酶Chk1是非常重要的细胞周期检测点调节蛋白，其蛋白的稳定表达有利于维护DNA损伤修复和细胞周期检测点调节，以保证细胞基因组的完整和稳定［1］。在临床上由于肿瘤细胞在化疗中逃避凋亡，许多通过损伤DNA使细胞凋亡的癌症治疗方案在疗效上十分有限， 而细胞逃避凋亡与细胞周期检查点的活化有关，因而有研究者试图通过抑制细胞周期检测点来增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，Chk1的研究为癌症的治疗带来了契机［6-8］。本研究应用RNA干扰技术使胃癌细胞株BGC823的Chk1基因沉默，旨在探讨抑制细胞周期检测点激酶Chk1对人胃癌细胞株BGC823增殖与细胞周期的影响。

本研究应用RNA干扰技术观察了Chk1 siRNA转染对BGC823细胞Chk1表达的影响，结果显示，将Chk1基因沉默后，通过Western blot检测，发现细胞中Chk1蛋白水下降明显，表明靶向Chk1 siRNA产生了序列特异性效果。在确保Chk1基因被有效沉默后，本研究针对Chk1蛋白表达缺失情况下的细胞，采取MTT法评价其增殖活性的变化。结果显示，相比未转染组和脂质体转染组，Chk1基因沉默后的BGC823细胞增殖活性明显下降，生长受到抑制。这些发现揭示一定水平的Chk1蛋白的表达是肿瘤细胞进行增殖活动所必需的。本研究还发现，Chk1 siRNA沉默目的基因对细胞周期产生了显著影响，使细胞周期阻滞在G0/G1期。Chk1表达的下调影响细胞增殖，其机制可能与G0/G1期阻滞作用相关。

Chkl参与G1/S检测点调控，G1/S 检测点阻止细胞进入S状态，当DNA受到损害不能进行复制时这种阻止就开始发生，为了适应 DNA的损害，G0/G1阻滞作用通过Chk1路径快速地发生［9］。本研究结果证实，Chk1表达下调可能通过诱导G0/G1期阻滞来抑制人胃癌BGC823细胞增殖，其具体分子机制有待于进一步研究。

综上所述，Chk1对人胃癌细胞生长和增殖起着重要的调控作用。Chk1基因沉默导致细胞增殖活性显著下降，细胞周期在G0/G1期发生阻滞，生长受抑。揭示Chk1蛋白可能直接或间接地参与细胞周期进程的调控。

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