手术标本中结核分枝杆菌检测及临床意义研究

吴晓光 陆宇 高孟秋 王子彤 韩鸣 马丽萍

(北京胸科医院 北京 101149)

结核病是结核分枝杆菌引起的严重危害人民生命健康的慢性传染性疾病。虽然人类发现结核分枝杆菌是结核病的致病菌已有上百年的历史,但对结核分枝杆菌生物学本质特别是结核分枝杆菌持留菌的认识仍需不断深入。临床上需外科手术治疗的结核病患者大多数曾长期反复抗结核治疗或未规律系统治疗,术中病灶取材进行结核菌培养对于术前化疗的判断以及持留菌的发现都将是很好的切入点。本研究在前期工作的基础上[1],对手术标本中结核分枝杆菌进行检测并探讨其临床意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 选取本院外科或骨科的住院肺结核、骨结核及淋巴结核患者,有不同疗程的化疗史,所接受化疗方案均含有H RZ,因病程迁延或气胸等原因行病灶切除治疗。

1.1.2 培养基 称取7H9培养基(美国Difico公司)4.7 g,溶于900 ml蒸馏水中,加入 2.0 ml甘油和0.5ml吐温-80,121℃高压10min,待使用前加入0.1体积分数的 OADC营养添加剂(oleic acid albumin dextrose catalase)。

1.2 实验方法

1.2.1 选取手术标本中肉眼见纤维化、干酪样病变连同边缘组织楔形取材,即刻用组织磨碎器研磨,分别接种及-70℃保存待提取RNA用。

1.2.2 取上述处理后标本0.1 ml,系列10倍稀释后,分别接种到改良罗氏培养基斜面上,每一稀释度接种 2支,置 37 ℃培养,24 h、72 h、1周 、2周、4周、8周分别观察生长情况,以8周生长为准计算菌落数目(CFU)。

1.2.3 取0.1 ml接种到含有抗菌素(100 U/ml多黏菌素 B、5μg/ml两性霉素 B 、25μg/ml羟氨苄青霉素)和0.05%吐温-80的7H9液体培养基中,分别置37℃进行有氧和低氧(培养基中氧浓度不超过1%)培养 ,24 h 、72 h 、1 周 、2 周 、4 周、8 周定期观察菌落生长情况。

1.2.4 mRNA的定量检测 测定结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)、小分子热休克蛋白(alpha-crystalli,ACR)和 85B蛋白 mRNA：RNA提取方法与文献[2]基本相同。ICL扩增引物：上游 5′-CCATGCGCTGAACTACTCGAT-3′;下游5′-AGT TCGACATACGCGCTCATC 3-′,扩增片段75 bp;结核分枝杆菌ACR和85B扩增引物同文献[7]。PCR 反应体系 25 μ l,包括10 mmol/L T ris-HCl(pH 值为 8.3)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、200 nmol/L 引物、250 nmol/L 探针、200 nmol/L dNTP、1 U Taq酶(美国Prommega公司)、DNA(cDNA)2 μ l。反应参数 ：95 ℃预变性 5 min,94℃变性30 s,54℃(Acr和85 B为60℃)复性30 s,40个循环。每次反应设阴性对照,未经逆转录反应的RNA同时进行聚合酶链反应(PCR),监测有无DNA污染。mRNA拷贝数/ml为cDNA拷贝数乘以用于RT及PCR反应时标本液稀释倍数。不同时间的样品分别分3份进行mRNA检测,测定后取均值。

2 结果

2.1 入选病例概况 所选取的12例标本手术前均经一定时间化疗后行外科手术治疗。其中男性6例,女性6例,病程半年以上至40年不等,化疗时间3～36个月,除病例4外其余患者均接受了含H RZ的治疗方案3月以上,肺结核患者9例,骨结核患者2例,淋巴结核患者1例,手术前痰结核菌集菌及罗氏培养检查均为阴性,具体情况见表1。

2.2 检测结果 将手术切除标本进行罗氏培养、7H9有氧、7H9低氧培养,并检测标本中结核分枝杆菌ICL、Acr、85B mRNA 的拷贝数,结果见表1。

3 讨论

本研究9例肺结核患者术前痰结核菌培养均阴性,术中病灶取材结核菌罗氏培养阳性7例,7H9有氧培养阳性8例,痰标本培养阴性,而手术标本中培养阳性,一方面说明手术标本结核菌培养的阳性率要高,因为培养的结核菌直接来自于病变部位,而非经呼吸道排出;另一方面说明经过一段时间化疗或较长时间的临床病情稳定期(无症状、X线胸片显示病灶稳定)痰培养已阴性并不是真正意义上的结核菌已彻底消除,体内很可能仍然存在具有活性病灶或存在不同代谢状态的菌群,这样的检测对术后的化疗起支持和指导作用。本研究因为是初步研究,病例数较少而且我们的药敏实验方法也在进行之中,认为对于手术标本结核菌培养阳性者继续行药敏测定,将对术后制定个体化抗结核方案有指导意义。本项研究中的7H9有氧培养阴性病例的出现可能与取材或磨碎方法有关,也可能是含菌量少受检测的限制。

表1 入选病例概况及标本培养检测结果

一般认为人体感染敏感结核分枝杆菌后,经正规方案(含有HRZ)化疗后,体内的结核分枝杆菌一旦进入持留状态,由于代谢途径的转变,使得原来对细菌敏感的药物变得无效。一系列体外试验和动物试验显示,在低氧、和高浓度药物的诱导下,一部分结核分枝杆菌为适应环境对其生存的不利影响(在体内条件下还存在有机体免疫系统对细菌的影响),不但形态发生改变,代谢途径也向乙醛酸支路转换而进入持留状态[3-5]。本研究7H9低氧培养阳性8例,其中固体培养阴性而有氧培养阳性的1例(病例7,29岁女性,左上空洞型肺结核,虽经12个月的抗结核治疗,但仍有间断咯血而采取手术治疗)。其余均为固体、7H9培养同时阳性,可能的原因是病灶中存在不同状态的细菌,在体外适宜的条件下生长,也可能是液体培养基中含有复苏因子使病灶中持留菌复苏生长[7-8]。

应用定量RT-PCR检测3种蛋白的mRNA表达,结合培养结果分析：有1例(病例8)是固体培养阴性,液体培养阳性,3种mRNA均有表达且ICL,Acr高表达,根据前期实验结果可以表明持留菌的存在,85BmRNA的同时表达说明在病灶中也同时存在活跃生长的菌,该病例为15年前患胸壁结核,HRZE化疗1年,13年前复发1次,继续HRZE抗结核药物治疗2年,达到临床痊愈;本次为第3次病灶复发,对于这种反复复发的病例,一般常规抗结核药物治疗只能杀灭复发后活跃增殖的细菌,对于进入持留状态的细菌则无效,因此不能达到彻底治愈结核病的目的,应该选用手术治疗,彻底消灭体内结核病灶。

临床上对于结核病复发者,经常考虑可能存在对一线药物耐药,此时多改变方案而采用含左氧氟沙星等的二线药物治疗,但也有部分继续采用原方案治疗再次获得痊愈的病例存在,根据结核菌持留状态代谢的特点,结核菌在持留状态时对药物不敏感,而一旦复发,结核分枝杆菌又恢复了其活跃增殖的代谢途径,因此,对结核一线药物的敏感性也随之恢复,因此再次应用一线抗结核药物仍然是有效的,香港的一项临床研究结果,也证实了结核菌持留状态的这一特性。况且二线药物比较一线药物,价格昂贵、不良反应多,必然为患者带来了巨大的身体和经济负担。

本研究结果表明手术标本是结核菌培养及持留菌检测的很好材料,对患者术后化疗方案有指导意义。由于本研究例数较少和选材及方法的限制,有待进行扩大病例和改进方法的进一步研究,为探索新的抗结核治疗提供细菌学基础和帮助。

[1]陆宇,高孟秋,赵伟杰,王彬 ,马丽萍,朱莉贞.结核分枝杆菌持留菌感染模型的建立和检测 [J].中华结核和呼吸杂志,2007(3)：211-215.

[2]陆宇,朱莉贞,段连山,梁桂芳,田苗.mRNA作为结核分枝杆菌活菌检测标志的可行性研究[J].中华结核和呼吸杂志,2003,26(7)：419-423.

[3]Lucy E.Desjardin,Ladonna G.Hayes.Microaerophilic induction of α-crystallin chaperone protein homologue(hspX)mRNA of Mycobacterium tuberculosis[J].J Bacteriol,2001,183(18)：5311-5316.

[4]Wiker HG,Harboe M.T he antigen 85 complex a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis[J].Microbiol Rev,1992,56(4)：648-661.

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[6]Mckinney JD Honer zu Bentrup K,Munzo-Elias EJ.Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase[J].Nature,2000,406(6797)：735-738.

[7]Hellyer T J,Desjardin LE,Hehman GL.Quantitative analysis of mRNA as a marker for viability of Mycobacterium tuberculosis[J].J Clin Microbiol,1999,37(2)：290-295.

[8]Hu YM,Butcher PD,Sole K.Protein synthesis is shutdown in dormant Mycobacterium tuberculosis and reversed by oxygen or heat shock[J].FEMS Microbiol Lett,1998,158(1)：139-145.