咪唑乙烟酸降解菌Y发酵培养基的优化

马 超，李晓雨，刘亚光

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

咪唑乙烟酸（Imazethapyr），是美国氰胺公司80年代初开发研制的咪唑啉酮类性除草剂，主要用于大豆田苗前防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草，具有杀草谱广、选择性强、活性高等优点[1]。目前中国主要在东北地区单季大豆田中使用，其中黑龙江省使用量最大，近几年使用量在4 000 t左右[2-3]。咪唑乙烟酸的残效期长，在土壤中的残留会对下茬敏感作物产生药害，3年内后茬禁种大豆、玉米、小麦以外的作物，尤其以甜菜、马铃薯、向日葵等经济作物对其极为敏感[4]，更由于其连年使用，残留药害问题日益突出，严重影响了种植业结构的调整和换茬轮作，已成为亟待解决的农业生产问题。因此，如何解决咪唑乙烟酸的残留药害问题一直受到国内外学者的关注，研究表明，在土壤表土层以下的咪唑乙烟酸不水解、不挥发，主要通过微生物降解而消失[5]。

目前采用富集分离的方法已经在受咪唑乙烟酸污染的土壤中筛选出一株能够高效降解咪唑乙烟酸的菌株Y，为海球菌属（Marinococcus），并对其生长特性、降解性能等方面进行了研究[6-7]。由于原培养基的发酵效率较低，且对于大规模生产存在成本高的问题，本文对已筛选出的咪唑乙烟酸的降解菌Y的发酵培养基进行了优化研究，以明确其最优发酵培养基组合，充分发挥菌种的生长潜力，提高降解菌产率，降低发酵成本，为降解菌剂的工业化扩大生产奠定基础，以期为生物修复该除草剂污染的耕地、解决换茬轮作调整提供一条有效途径。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

咪唑乙烟酸降解菌Y，为海球菌属（Marinococcus），由东北农业大学农学院农药与杂草教研室提供。

1.2 供试培养基

种子培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0；

初始发酵培养基：葡萄糖10 g，酵母粉10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

1.3 发酵培养条件

在250 mL三角瓶中装入50 mL发酵培养基，以5%的接菌量接菌，接菌后于温度为30℃，转速为120 r·min-1的摇床中进行发酵培养30 h。

1.4 降解菌Y生长量的测定方法

发酵液经过滤后，以未接种的发酵培养基作对照，采用紫外分光光度计在650 nm下比色测定降解菌Y的数量。

1.5 试验方法

1.5.1 碳源筛选试验

选取葡萄糖、淀粉、玉米面、麦麸皮、米糠、玉米秸秆和大麦粉分别替换初始发酵培养基中的碳源，添加浓度不变，培养基中其他组分不变，按上述摇瓶发酵条件培养，测定降解菌Y的生长量，比较各种碳源对降解菌Y生长量的影响。

1.5.2 氮源筛选试验

选取黄豆粉、豆粕、酵母粉、蛋白胨、尿素、NaNO3、NH4NO3和（NH4）2SO4，分别替换初始发酵培养基中的氮源，添加浓度不变，培养基中其他组分不变，对降解菌Y进行摇瓶发酵培养，测定降解菌Y的生长量，比较各种氮源对降解菌Y生长量的影响。

1.5.3 无机盐筛选试验

选取 ZnSO4，MgSO4，K2HPO4，FeSO4，MnCl2，CaCl2，CoCl2等作为唯一无机盐，并设置不同的浓度，分别替换初始发酵培养基中的无机盐，对降解菌Y进行摇瓶发酵培养，比较不同浓度的无机盐对降解菌Y生长的影响。

1.5.4 发酵培养基正交试验设计

在单因子试验的基础上，综合考虑各个因素对发酵的影响，选取麦麸皮、米糠、豆粕、酵母粉、NaCl、CaCl2和FeSO4作为组分因子，采用L18（37）正交试验设计表进一步优化培养基组成，试验结果运用DPS软件进行统计处理分析，确定最佳培养基组合。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对降解菌Y生长量的影响

碳源是组成培养基的主要成分之一，其主要作用是供给菌种生命活动所需要的能量和构成菌体细胞成分和代谢产物中的碳素来源[8]。由图1可知，麦麸皮和米糠作为碳源时降解菌Y生长量最高，与其他5种碳源差异显著，其次是大麦粉、玉米面、玉米秸秆和葡萄糖，并且菌株利用淀粉的能力不强，大量多糖无法被菌体利用从而影响菌体的生长。麦麸和米糠的价格低廉，取材方便等特点作碳源适于大规模生产，因此选择麦麸和米糠作为发酵培养基的碳源。

图1 不同碳源对降解菌Y生长量的影响Fig.1 Influence of different carbon sources on the biomass of degrading bacteria Y

2.2 不同氮源对降解菌Y生长量的影响

结果见图2。

氮源微生物发酵中的主要原料之一，其主要功能是构成微生物细胞和含氮的代谢产物，常用的氮源含有机氮源和无机氮源两大类[9]。由图2可以看出，选择豆粕和酵母粉作为氮源时菌体生长量较大，方差分析可知与其他氮源相比有显著差异，其次为蛋白胨、硝酸铵、硝酸钠和硫酸铵，降解菌Y对豆粉和尿素的利用能力很低。酵母浸粉是常用的速效氮源，豆粕是良好的持效氮源，为降解菌Y持续良好的生长和工业化生产的需要，选择这两种氮源配合作为发酵培养基氮源。

图2 不同氮源对降解菌Y生长量的影响Fig.2 Influence of different nitrogen sources on the biomass of degrading bacteria Y

2.3 不同无机盐及质量分数对降解菌Y生长量的影响

无机盐是微生物生命活动所不可缺少的物质，其主要功能是构成菌体成分、作为酶的组成成分、调节并维持细胞的渗透压平衡等[10]。结果如表1所示，在所选的8种无机盐中NaCl和CaCl2对降解菌Y的生长均有较显著的促进作用，并且随着其添加质量分数的增加降解菌Y生长量也随之增加，两者都在质量分数为0.8%时菌体生长量达到最大；FeSO4在质量分数为0.01%时菌体生长量最大，但随添加的质量分数增加到0.07%时菌体生长量有所下降。而 KH2PO4，MgSO4，ZnSO4，MnCl2和 CoCl2对菌体生长有明显抑制作用，且随浓度的增加抑制作用也增强。

表1 不同无机盐对降解菌Y生长量的影响Table 1 Influence of different inorganic salt on the biomass of degrading bacteria Y

2.4 正交试验结果

正交试验的因素及水平见表2，正交试验结果见表3。通过均值间比较可以看出发酵培养基的最优组合为 A2B3C3D2E2F2G3，即麦麸皮 2%，米糠2.5%，豆粕2%，酵母粉1%，NaCl 0.8%，CaCl20.6%，FeSO40.015%。分析极差值的大小得出影响降解菌Y生长的因素依次为：豆粕＞麦麸＞米糠＞酵母粉＞FeSO4＞CaCl2＞NaCl，经方差分析各因素在0.05水平上均不存在显著性差异，分析认为单因素试验中确定了各个因素的质量分数范围，正交试验设计质量分数波动较小，因此结果间差异不显著。

表2 发酵培养基优化的正交试验因素和水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test for fermentation medium optimization （%）

表3 正交试验结果分析Table 3 Analysis the rsulsts of orthogonal design

3 讨论与结论

发酵培养基的组成应做到适当丰富和完备，满足菌体迅速生长需要，营养过多或过少都不利于菌体的生长，营养不足会导致菌体提前进入衰亡期，产量减少；营养过多会导致菌代谢途径发生一定的改变，造成底物抑制，不仅生物量减少，同时造成产物量减少，对产物的合成有明显的抑制作用。

本试验首先对生产上常使用的碳源、氮源和无机盐进行了单因素的初筛，从中得出适合菌体生长的碳源、氮源及无机盐，缩小了优化的范围，以便进一步运用正交试验法进行优化。最后确定了咪唑乙烟酸降解菌Y的发酵培养基最优组合：麦麸皮2%，米糠2.5%，豆粕2%，酵母粉1%，NaCl 0.8%，CaCl20.6%，FeSO40.015%。优化后的培养基中各组分满足原料取材方便，来源广泛，价格低廉的原则，适于工业化生产的需要。本研究后续工作将对该菌株的发酵条件进行优化，并在30 L发酵罐中进行验证。

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