盾叶薯蓣组培快繁技术研究

周雄祥，肖建洲

（1.湖北省农业厅蔬菜办公室，湖北武汉，430070；2.长江蔬菜杂志社）

盾叶薯蓣（Dioscorea ZingiberensisC.H.Wright）又名黄姜，为薯蓣科薯蓣属单子叶植物，是迄今发现的能大量合成皂素的植物药源之一，被誉为“药用黄金”[1]。盾叶薯蓣主要以块茎进行无性繁殖，其繁殖系数低，且种性退化严重，块茎中皂素含量也极不稳定，优质种苗的严重不足在很大程度上制约了盾叶薯蓣规模化生产[2]。因此，选择和培育皂素含量高的盾叶薯蓣优良品种，并大规模生产高质量种苗，是解决当前薯蓣生产问题的有效途径。本研究采用组织培养技术，对盾叶薯蓣的快速繁殖进行了研究，期望为生产提供大量优质种苗，促进盾叶薯蓣的规模化生产。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料为盾叶薯蓣二年生根状茎，以生长约4个月的植株的幼嫩茎尖、嫩叶和幼嫩果荚为组织培养起始材料。

1.2 外植体制备

以幼嫩茎尖、叶和果荚为外植体。外植体置于自来水下冲洗30 min后，转入加有1滴吐温20的0.1%升汞溶液中消毒 6～8 min，中途振荡 2～3 次，然后用无菌水漂洗4次。消毒后的外植体置于无菌培养皿中，用解剖刀将其切割成适当大小（叶片和果荚约 0.5 cm×0.5 cm，茎段长约 0.3 cm），并接种于培养基上。

1.3 试验方法

整个试验所用的培养基为MS培养基[3]基本配方，并附加不同浓度的生长素和细胞分裂素。试验共设4种愈伤组织诱导培养基，4种芽分化培养基和3种芽增殖培养基，以不加任何激素的MS培养基为生根培养基。各种培养基的具体配方见表1。

所有培养基均添加0.2%活性炭，30 g/L蔗糖和0.7 g/L琼脂，pH值在灭菌前调至5.8。生长调节物质均在高压灭菌前加入，高压灭菌条件为121℃保持20 min。接种后外植体置于1 500 lx光照强度下诱导愈伤组织，于光照强度为4 000 lx、光照时间16 h/d条件下诱导芽分化和增殖。培养过程中温度保持在（25±1）℃。

表1 试验所用的培养基

外植体或愈伤组织按不同处理接种，每个处理至少有20个外植体或愈伤组织块，每处理重复3次。定期统计出愈率、出芽率和增殖率等指标。百分比转化为正弦值后利用邓肯氏新复极差法进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 外植体类型对愈伤组织诱导的影响

外植体接种到愈伤组织诱导培养基上1周后，几乎所有的茎段切口处都出现膨大，呈哑铃状；幼嫩果荚横切面接触到培养基部分出现膨大；嫩叶四周切口处出现不同程度的肿胀，整个叶片增厚并隆起呈瓦片状。约30 d后，各类外植体开始愈伤组织化，茎尖首先出现愈伤组织（30 d），果荚和嫩叶则稍晚（分别为45 d和40 d）。不同类型外植体诱导愈伤组织的难易程度不一致（表2）。果荚出愈率最高（54.4%），茎尖次之（51.3%），但与果荚差异不显著，嫩叶的出愈率最低（12.8%）。综合考虑以上因素，茎尖外植体出愈率高，不易污染，且愈伤组织诱导时间短，是组织培养较理想的外植体材料。

2.2 不同激素组合对愈伤组织诱导的影响

试验所设计的4种愈伤组织诱导培养基均能诱导愈伤组织产生，但不同培养基的出愈率和愈伤组织状态有所不同。由表3可知，愈伤组织诱导率最高的是 C 培养基（69.8%），D 次之（56.8%），A 和B培养基效果不理想 （出愈率分别为 32.9%和43.1%）。由此可知，盾叶薯蓣对生长素种类有一定的选择性，NAA的效果比2，4-D好。从愈伤组织的状态来看，生长素为NAA的培养基上愈伤组织呈绿色或浅绿色，结构紧凑，而添加2，4-D的培养基则容易促使愈伤组织崩裂，其愈伤组织多为淡黄色半透明或水渍状，不利于以后分化成苗。结构紧密型愈伤组织在C和D培养基上能稳定增殖并保持其状态，而疏松型愈伤组织转入到C或D培养基继代3～4次方可转变成结构紧密型愈伤组织。

2.3 不同激素组合对愈伤组织芽分化的影响

结构紧密型愈伤组织转入到芽分化培养基上1周后开始出现芽点，芽周围有白色的鳞片包被，3周后分化出芽。表4显示了培养3周后的出芽情况。H培养基上最有利于愈伤组织分化，出芽率最高（90.9%），但平均出芽数仅有 3.2个。 G 培养基也能有效的促使愈伤组织分化，其出芽率（86.2%）仅次于G培养基，平均芽数最多（6.8个）。F培养基出芽率和平均出芽数均不如G，H培养基。E培养基出芽率最低（16.3%），平均出芽数稍高（5.2 个）。 试验中观察发现，尽管E，G培养基（仅含有BA或KT）平均出芽数较高，但这些芽大多为细小的丛生芽，难以复壮、成活。而F，H培养基（含有NAA和BA或KT）平均出芽数少，但芽生长健壮，容易成活。综合分析可知，H培养基的芽分化效果最好。在H培养基上，不定芽再经1～2周即可成为具有数个结节的植株。

表2 外植体类型对愈伤组织诱导的影响

表3 不同激素组合对愈伤组织诱导的影响

表4 不同激素组合对愈伤分化成芽的影响

表5 不同激素组合对腋芽增殖的影响

2.4 不同激素组合对腋芽增殖的影响

盾叶薯蓣具有结节，因而可通过产生腋芽进行增殖。将幼嫩植株切成数个茎段 （每个茎段1个节），接种在芽增殖培养基上1周后，腋芽开始萌动并伸长，每个节段可发生数个不定芽。接种3周后的统计结果见表5。K培养基促使腋芽增生的效果最好，增殖率达 77.1%，单节平均芽数达 6.2 个；I，J培养基也能促使腋芽增殖，增殖率和单节平均数稍低，两者之间差异不显著。试验中发现，尽管K培养基的增殖效果最好，但节间容易产生瘦小的丛生芽，生长速度慢；而I，J培养基尽管单节出芽数少，但腋芽生长健壮，生长速度快，容易成活。因而，从再生苗的质量角度考虑，I，J培养基适宜于腋芽增殖。

2.5 再生苗生根

从增殖培养基上切取长1～2 cm的腋芽，接种在不加任何激素的MS培养基上，1周后芽基部开始出现白根。经统计，腋芽的生根率几乎为100%。

3 小结与讨论

离体条件下，盾叶薯蓣可以通过愈伤组织形成再生植株，也可以通过腋芽增殖而产生再生植株，这两种器官发生方式均可以实现盾叶薯蓣的快速繁殖[4]。从现有的报道来看，大多试验均以盾叶薯蓣茎尖为起始材料来建立离体培养，本试验也证明，含有大量分生组织的茎尖外植体出愈率高且不易污染，是较理想的外植体。试验还发现，叶片和幼嫩果荚也能诱导出愈伤组织，叶片的出愈率要低于茎尖，但幼嫩果荚的出愈率却要高于茎尖，这可能是与其性器官中含有大量胚性组织有关。

2，4-D和NAA与BA组合均能诱导出愈伤组织，虽然2，4-D能迅速刺激外植体愈伤组织分化，但愈伤组织大多半透明或水渍状，不易分化成苗，偶尔还可以见到胚状体产生。NAA则可诱导产生结构紧凑的愈伤组织，并能支持其稳定生长与分化。许多组织培养试验表明，2，4-D可使细胞或组织通过胚胎发生途径产生植株，而NAA一般只能使细胞或组织通过器官发生途径产生再生植株[5]，本试验也证实此观点。

在添加较高浓度细胞分裂素的培养基上，愈伤组织能分化成苗，但单独使用细胞分裂素容易导致丛生芽产生。本试验观察到，高浓度细胞分裂素配合低浓度生长素得到较高的芽分化率，这一结果也支持了Skoog和Miller提出的 “激素平衡”学说[6]。尽管BA和KT均能促使不定芽的分化与增殖，但添加KT的培养基上的芽分化率和平均出芽数比添加BA的培养基上要高 （尽管KT诱导的芽大多为丛生芽），说明KT的细胞分裂素活性比BA强。

盾叶薯蓣因有腋芽分生组织而能通过腋芽增殖而实现离体快繁，高浓度的BA与低浓度的NAA配合（BA/NAA≥2），可以支持盾叶薯蓣茎段快速增殖。一般来说，通过腋芽增殖的扩繁方式要优于通过愈伤组织的繁殖方式，因为愈伤组织诱导和增殖都是细胞快速分裂的结果，不可避免的造成体细胞无性系变异，而腋芽增殖则可大大降低这种变异程度，能保证其繁殖群体较高，性状一致性。因此，盾叶薯蓣的快速繁殖可直接通过茎段外植体（或愈伤组织初代培养产生的植株）诱导腋芽增殖，以保证获得高质量的组培种苗。

[1]赵猛，朱洪梅.盾叶薯蓣种质资源研究进展[J].陕西农业科学，2009（1）：71-74.

[2]张友德，芦煜照.黄姜有性繁殖研究[J].华中农业大学学报，1999，18（1）：8-10.

[3]Classic M T,Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture[J].Physiol Plant,1962,15:473-497.

[4]蒋玉宝，于元杰.薯蓣植物组织培养的研究进展[J].生物技术，2006，16（14）：93-96.

[5]Murashige T.Plant propagation through tissue cultures[J].Ann Rev Plant Physiol,1994，25:135-166.

[6]Skoog F,Miller C O.Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue culture in vitro [J].Symp Soc Exp Biol,1957,11:118-131.