以适体作为药物“靶向载体”的研究进展

杨传旭，葛志强

药物的靶向给药已成为近年来药物输送系统领域研究的热点。药物的靶向可分为被动靶向和主动靶向，被动靶向是指依靠药物自身的设计或所制备的药物载体的粒径、形状等因素减少与非靶细胞、组织及器官的非特异性相互作用来增加靶部位/非靶部位的药物水平比率。而主动靶向是指利用抗原-抗体结合或配体-配基结合等生物特异性相互作用来实现药物的靶向传递，目前可作为主动靶向的配体或“靶向载体”的主要是抗体、多肽、叶酸、多糖。而近几年国外以核酸适体（aptamer）（包括 DNA 或 RNA）作药物主动靶向给药载体的研究日益受到研究人员的关注，已成为主动靶向给药系统研究领域的新课题。核酸适体是一段寡聚的单链 DNA 或 RNA，一般由 20～80 个碱基构成，分子量介于 6～25 kD，能折叠成特殊的三维结构，特异性地识别并结合蛋白质、糖类、核苷酸等分子[1]。大量研究结果表明，通过设计核酸适体与药物的结合体，能够实现药物或药物载体的靶向传递，提高药物疗效并减轻不良反应，为主动靶向给药系统的开发提供了新的方向。本文就以适体作为药物靶向载体的研究进展做一简要综述。

1 核酸适体作为“靶向载体”的优势

选择一种具有高特异性与亲和性的“靶向载体”一直是制约主动靶向给药系统研究的瓶颈。虽然抗体、多肽和叶酸等分子已有作为药物靶向载体研究成功的报道，但这些化合物应用均存在着目前难以克服的缺陷。例如，单克隆抗体由于潜在的免疫原性（immunogenicity）和制备的困难大大限制了其临床的应用和产业化的进程[2]；叶酸等虽然易于制备，但要求病变组织细胞具有足够多的叶酸受体，而且由于正常组织细胞也存在叶酸受体，导致其靶向作用并不理想[3-4]，而核酸适体却具有以下优点：

⑴核酸适体与靶细胞结合的特异性和单克隆受体相似，甚至更高。核酸适体识别并结合靶点的机制在于其折叠为特定三维结构，暴露出活性位点与受体发生特异性作用。特别是通过近期发展起来的全细胞配体系统进化的指数富集（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）筛选技术[5]、细胞表面靶点 SELEX 技术[6]和单株SELEX 筛选技术[7]得到的适体对受体具有高度的特异结合能力。

⑵核酸适体没有明显的免疫原性[8]。适体介导的靶向药物注入人体内不会引发免疫反应，因此，在医药应用领域比单克隆抗体更加安全可靠。

⑶核酸适体分子体积较小，比单克隆抗体更易穿透组织和器官。同时，当核酸适体连接到药物载体表面时，系统的体积不会有很大地增加，使药物载体体积更容易控制。

⑷核酸适体容易进行各种化学修饰扩展其应用范围，例如通过放射性标记、荧光素、生物素的修饰用于监测和识别肿瘤细胞[9]。

⑸核酸适体的制备方便，且比单克隆抗体有更高的稳定性，可以在许多缓冲溶液中保存，所以在生产、储存和运输当中有很大的优势[10]。

⑹核酸适体结构的多样性导致其具有广泛的受体范围，从小分子到蛋白质，甚至到细胞[11-13]。正由于其受体广泛的特性，适体可以作为多种疾病的寻靶“引导子”。

2 核酸适体在靶向制剂中的应用

2.1 适体-药物结合体

药物的靶向性和活性的保持，是靶向药物成功设计和制备必须考虑的因素。现行的设计方案多是将药物与配体通过共价键或非共价键相连接成为复合体。为使两者能连接，通常要先对药物或配体进行适当的化学修饰，而修饰的结果往往会影响药物的安全性和有效性。所以，理想的方法是提出一种可以不需要对两者进行化学修饰的制备策略。

适体是单链的 DNA 或者 RNA，可以特异地并高亲和性地与小分子、肽段、蛋白质、寡聚核苷酸相结合，因此可不经过化学修饰与药物分子稳定结合，在保持药物活性的同时对受体蛋白具有特定靶向作用。Bagalkot 等[13]将多柔比星扁平的芳香环与核酸适体 A10 三维构象中的短链结构通过非共价作用连接，成功制备了适体-多柔比星结合物，此结合物的解离常数 Kd= 600 nM，具有很高的稳定性。该试验采用的适体 A10 能特异性靶向结合前列腺癌变细胞表面抗原（PSMA）。荧光光谱法测试表明，该适体-多柔比星结合物对 LNCaP（PSMA+）细胞具有高度的特异靶向作用。同样，核酸适体也可在蛋白药物的靶向输送上起到较好的作用。如分子量为 2.8 × 104的细胞毒蛋白 gelonin 可通过破坏 rRNA 的糖苷键阻断蛋白质的合成，从而有效杀死肿瘤细胞。但gelonin 本身缺少介导其转移的肽区，所以不能有效进入细胞中，因此阻碍了其应用开发。Chu 等[14]将gelonin 与 anti-PSMA 适体连接，发现其对 PSMA 阳性的LNCaP 细胞的毒性比 PSMA 阴性的 PC3 细胞大 600 多倍，且适体-gelonin 结合体的细胞毒性是单用 gelonin 的180 倍。此外，核酸适体还可以与酶类直接结合构成结合体，促进靶细胞对酶的特异性内吞作用。如 Chen 等[15]经过筛选得到的 RNA 适体 FB4 和DNA 适体 GS24 可特异地结合大鼠成纤维细胞转铁蛋白的细胞外区域，将这两种核酸适体分别与 α-L-艾杜糖醛酸酶连接构成结合体，可有效地将 α-L-艾杜糖醛酸酶运送到缺乏该酶的细胞溶酶体内，为酶的替代治疗提供有效方法。

2.2 适体-脂质体结合体

以前对于脂质体的研究集中于长循环脂质体，通过细胞的高渗透和高保留效应（EPR effect）进行被动靶向作用，然而这种依据 EPR 的靶向性仍然存在不良反应大和选择性不高的现象。为了克服被动靶向的低选择性，以适体靶向引导脂质体的药物运输系统的主动靶向成为当前研究的热点。Cao 等[16]成功制备了以顺铂为治疗药物的核酸适体-脂质纳米囊的靶向制剂。他们选择对核仁蛋白（在乳腺癌细胞的质膜表面过量表达）具有较高特异亲和性的核仁蛋白（nucleolin，NCL）-适体作为顺铂脂质纳米囊的“靶向载体”。用连接了 NCL-适体的顺铂脂质体处理后的乳腺癌 MCF-7细胞存活率仅为 40.5%，而用未连接 NCL-适体的顺铂脂质体处理，存活率高达 88.9%。可见，该 NCL-适体大大地提高了药物的化疗效果。同时，通过比较 MCF-7 细胞与 LNCaP细胞（细胞膜无核仁蛋白表达）对连接了 NCL-适体的顺铂脂质体的内吞作用，表明该适体对 MCF-7 细胞具有很好的选择性，这样可以大大减少顺铂脂质体的毒副作用。

Kang 等[17]筛选得到了对白血病 CEM-CCRF 细胞具有高度亲和性的 sgc8 适体，以该适体作为“靶向载体”与包裹了荧光素-右旋糖酐（FITC-Dextran，FD）的脂质体相连构成靶向脂质体，将其与具有 sgc8 受体的 CEM-CCRF细胞和无 sgc8 受体的急性早幼粒细胞白血病 NB4 细胞共同培养，结果表明该靶向脂质体对白血病 CEM-CCRF 细胞具有高度选择性。这些结果为具有良好载药量、安全性和靶向性的脂质体开发奠定了实验基础。

2.3 适体-纳米粒结合体

纳米粒具有良好的稳定性、可控释性和易于工业生产等特点，如能兼具主动靶向性能则更适合作为药物传递系统载体。Farokhzad 等[18]以核酸适体 A10 作为“靶向载体”，通过 PEG 与包裹有模型药物右旋糖酐的纳米粒相连构成适体-PEG-纳米粒复合物，由于适体 A10 的存在，使得前列腺癌 LNCaP 细胞（PSMA+）对该结合体的吸纳能力比没有适体的 PEG-纳米粒复合物提高了 77 倍。此后该作者进一步进行了体内试验[19]，以接种了前列腺癌 LNCaP 细胞（PSMA+）的裸鼠为动物模型，以包裹了多西紫杉醇的纳米粒为药物载体与核酸适体 A10 通过 PEG 连接构成结合体，一次瘤体内注射 40 mg/kg，观察 109 d 后发现注射该结合体的肿瘤体积的增长被强烈抑制，只是注射了含药脂质体肿瘤体积的三分之一。同时发现核酸适体组与单纯载药脂质体组的裸鼠的体重下降存在明显差异，前者下降了7.7%，而后者下降了 18%。此外，前者 109 d 的存活率是100%，而后者只有 57%。这些数据说明核酸适体-纳米粒结合体具有较高的药物疗效和安全性。

2.4 适体-siRNA 结合体

siRNA 即小分子干扰 RNA（small-interference RNA，siRNA），可使某些与疾病发生有关的特定基因沉默或表达水平降低，从而阻断某种特定蛋白质的表达，有效治疗疾病。目前 siRNA 类作为药物的研究已在多种疾病治疗领域取得了较好进展[20]。然而，siRNA 治疗技术也存在着一些需要解决的问题，怎样有选择性地将外源性小分子 RNA 输送到病变细胞仍然是影响该技术进一步应用到临床治疗上的主要障碍[21-22]。

靶向性传递 siRNA 不仅可提高生物利用度，减少使用量，更重要的是可避免对正常细胞产生毒副作用。目前已有报道将核酸适体作为“靶向载体”介导 siRNA 的输送。核酸适体与 siRNA 结合的构型设计常见的有两种：一种是将链霉亲和素-生物素复合物作为连接核酸适体和siRNA 的“桥”（图 1A）[23]，这种结构能够有效地、特异性地进行siRNA 的输送，即克服了脂质体输送 siRNA 的非特异性，又避免了以肽为输送载体的工艺复杂性。第二种结构更为简单（图 1B）[24]，核酸适体与 siRNA 直接构成的结合体作为传递的系统。当这种结合体进入靶细胞后，在 dsRNA 酶Dicer 的作用下将 siRNA 从结合体上切下。McNamara 等[25]将核酸适体 A10 与 siRNA 制成结合体，干扰前列腺肿瘤LNCaP（PSMA+）细胞生存所需基因的表达，在体外实验中可以观察到肿瘤细胞的生长受到明显抑制。Zhou 等[26]筛选出 HIV 的 gp120 包膜蛋白的特异性核酸适体，并制备了与相关 siRNA 的结合体，成功地抑制 HIV 病毒的复制和传染能力。该研究制备的结合体中的适体和siRNA 都对 gp120 蛋白的基因表达有抑制作用，在达到靶向性的同时也起到了协同作用的效果。

图1 核酸适体与 siRNA 结合的构型

3 结语

适体从应用于药物筛选、蛋白检测、生物传感器到如今作为药物治疗的“靶向载体”，越来越多的科研人员投身于适体技术及其应用的研究之中，并取得了重大进展，为核酸适体在药物靶向制剂的应用开拓了美好前景。然而，在此领域仍然面临着很大的挑战，特别是在癌症和病毒感染的治疗方面，还存在药物或载体与核酸适体连接、适体与靶点结合强度以及生产扩大化等方面的问题，且安全性仍待进一步评价。

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