栀子苷对大鼠局灶性脑缺血模型缺血脑组织HIF-1α蛋白和RTP801的影响

辛海涛 王卫宁

缺氧诱导因子-1[1](HIF-1)是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物及人体的一种转录因子。迄今发现HIF-1的直接启动基因有60多个，其中包括一些对缺氧适应性基因，如促红细胞生成基因、EPO编码基因等，还有一些HIF-1依赖的凋亡相关基因，如caspase、RTP801、bcl-2等。在严重缺血缺氧时，HIF-1可激活凋亡途径，HIF-1诱导神经细胞凋亡在缺血缺氧损伤的病理过程中起重要作用。RTP801[2]是HIF-1α依赖的凋亡相关基因，严重的局灶性脑缺血时，HIF-1促进RTP801的表达，神经元凋亡增加。凋亡在脑缺血再灌注损伤的发病机制中发挥着重要的作用[3]，且在梗死形成过程中发挥了重要作用。栀子苷对脑缺血再灌注损伤具有保护作用[4]，但机制尚不明确。为此本研究采用大鼠脑缺血再灌住模型，观察药物对脑组织细胞凋亡及细胞凋亡级联反应途径关键蛋白HIF-1α的含量和HIF-1依赖的凋亡相关基因RTP801 mRNA表达的影响，深入研究其脑保护的分子机制。

表1 免疫组织化学染色显示各组大鼠海马CAI区HIF-1α阳性细胞数(个/高倍视野，40×10倍)

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康雄性SD大鼠(体重300～350g)，随机分为假手术组、模型组、栀子苷(低剂量、中剂量、高剂量)组和尼莫地平组，后者为阳性对照组，每组均为8只动物。

1.2 动物模型制作 参照Longa法[5]，用3.5%的水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，手术分离右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈外动脉(external carotid artery，ECA)和颈内动脉(internal carotid artery，ICA)，结扎ECA和CCA近心端，于CCA远心端备线，于ICA近心端置一动脉夹，在CCA近分叉处剪一约0.2mm的‘V’字形切口，插入栓线，插入深度(18.5±0.5)mm，使栓线进入ICA，到达大脑前动脉(anterior cerebral artery，ACA)起始部，阻断大脑中动脉的血液供应。假手术对照组不插入栓线，其他步骤同模型组。选取模型成功的标志为大鼠苏醒后出现同侧Horner征和对侧以前肢为重的偏瘫。

1.3 给药方式及途径 采用腹腔注射方式给药，栀子苷(低剂量、中剂量、高剂量)组、尼莫地平组造模前1h均预防性给药1次。各给药组分别给药3、6、12、3mL/kg，给药用生理盐水稀释至24mL/kg间隔4h第2次给药，2次给药后10h第3次给药。模型组腹腔注射生理盐水24mL/kg，栀子苷由课题组制备，浓度4.0mg/mL；尼莫地平购至拜耳医药保健有限公司，批号J20050050，规格0.2mg/mL。

1.4 免疫组化 各组动物缺血1h，再灌住24h，迅速断头、取脑。取视交叉前后1mm脑组织做石蜡切片。石蜡切片用于免疫组化染色，一抗为HIF-1α的单克隆抗体为1∶100(Santa Cruz公司，美国)，二抗及辣根酶标记链酶卵白素为1∶200(北京中山生物技术有限公司)，DAB镜下显色。HIF-1α阳性细胞是细胞质和(或)细胞核着色呈棕黄色。每张切片均在左侧大脑皮质缺血半暗带区，高倍视野下(40×10)计数200个神经元细胞中的阳性细胞数。

1.5 RT-PCR 大鼠麻醉后迅速断头取脑，在冰盒上迅速分离双侧海马，置冻存管中后放于-80℃低温冰箱保存。Trizol试剂盒提取-80℃保存的脑细胞总RNA，程序参照试剂盒操作手册，反应体系20μL，核酸分析仪对RNA样品定量。RT-PCR反应引物由宝生物公司合成，RTP801上游引物：5’-AAGAGCTGCCATAGTGTGGCT-3’，下游引物：5’-TTCAGACCATGAGATCTGTCG-3’；β-actin上游引物：5’-ATGGATGACGTATCGCTG-3’，下游引物：5’-ATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3’，PCR程序：94℃2min，94℃30s，56℃30s，72℃45s共35个循环，72℃5min，4℃保存。扩增产物5μL 加样于2%琼脂糖凝胶，常规电泳，紫外灯下观察结果，用Bio-rad凝胶分析系统对PCR产物进行半定量分析。

1.6 统计学处理 用SPSS统计软件处理数据，结果以(±s)表示，采用t检验。

图1 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

2 结果

2.1 栀子苷对缺血脑组织HIF-1α表达的影响 各组大鼠海马CAI区HIF-1α的表达详见表1。假手术组亦有少量表达，模型组的表达增加，各治疗组的表达比模型组减少，并且呈剂量依赖性，但仍高于假手术组，各治疗组HIF-1α的表达与假手术组、模型组相比都有显著性差异(P＜0.05)。

2.2 RT-PCR检测RTP801 mRNA的表达 在假手术组大鼠海马中未见RTP801mRNA的表达，而模型组中可见RTP801mRNA的表达增加，治疗组中RTP801mRNA的表达与模型组相比减少，而且随着治疗药物剂量的增加，RTP801 mRNA的表达量逐渐减小(图1)。

3 讨论

栀子苷治疗后大鼠海马CAI区HIF-1α的表达量下降，与模型组、尼莫地平组相比都有显著性差异(P＜0.05)；RTP801 mRNA的表达与模型组相比减少，而且随着治疗药物剂量的增加，RTP801 mRNA的表达量逐渐减小。本实验证明栀子苷对局灶性脑缺血急性期的神经保护作用，其可能机制之一为栀子苷抑制局灶性脑缺血损伤引起的的HIF-1α过渡表达，减少HIF-1依赖性凋亡相关基因RTP801的表达，减少神经元凋亡，从而减轻了缺血造成的损伤，起到了一定的神经保护作用，其作为脑缺血临床治疗具有一定的前景。但是，关于栀子苷在局灶性脑缺血病理过程中的应用最佳剂量、最佳时期以及副作用等方面还有待于进一步深入探讨。

[1]王晗,韩忠朝.缺氧诱导因子-1与细胞凋亡[J].国外医学:生理.病理科学与临床分册,2005,25(1):52-54.

[2]Tzipora Shoshani,Alexander Faerman,IgorMett,et al.Identification of a novel hypoxia-inducible factor 1-Responsive Gene,RTP801，involved in apoptosis[J].Molecular and Cellular Biology,2002,22(7):2283-2293.

[3]冯俊奇,李秀兰,白人骁.细胞凋亡机制研究进展[J].国际生物医学工程杂志,2006,29(1):45-64.

[4]张小燕,张占军,王忠,等.栀子苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织基因表达谱的影响[J].中国中西医结合杂志,2005,25(1):42-44.

[5]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.