复方伊维菌素和吡喹酮注射液的研制

牛丽娟,汤树生,郭召旭,陈琳琳,赵婷婷,聂 严,万仁玲,肖希龙

(1.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193;2.中国兽医药品监察所,北京 海淀 100081)

近年来,由于线虫、绦虫、吸虫以及体外寄生虫等多种不同类型寄生虫混合感染增多[1-3],使兽医临床迫切需要对上述多种寄生虫均有效的抗寄生虫新型复方制剂,而我国抗寄生虫复方制剂的研究基本处于空白阶段,至今未有效果较好的抗寄生虫复方制剂上市。因此,在我国研制对多种不同类型寄生虫感染均有效的抗寄生虫新型复方制剂已迫在眉睫。本文的研究目的是以当前兽医临床常用的伊维菌素(主治线虫和体外寄生虫)和吡喹酮(主治绦虫和吸虫)为主要原料,研制伊维菌素和吡喹酮的复方注射液,为我国兽医临床提供一种使用方便且对动物寄生虫混合感染具有较好疗效的抗寄生虫复方制剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料 伊维菌素(96.2%)和吡喹酮(99.6%)原药系浙江海正药业股份有限公司馈赠;伊维菌素对照品(94%,Sigma公司);吡喹酮对照品(99.5%),中国兽医药品监察所。

1.2 复方注射剂的研制 从多种有机溶剂中筛选出对伊维菌素和吡喹酮均有较好溶解性能,且无配伍禁忌和变色反应的溶剂作为本注射液的溶剂体系;从多种常用抗氧化剂和止痛剂中筛选出适合本制剂的理想抗氧化剂和止痛剂等适宜助剂。

1.3 正交试验 为确定所选抗氧化剂和止痛剂的最佳用量,各对其设高、中、低3个水平按正交表L9(34)进行正交试验,正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

1.4 伊维菌素含量检测方法

1.4.1 色谱条件 紫外检测器;色谱柱(SHIMADZU UP-ODS,5 μ m,150 ×4.6 mm);流动相 :乙腈∶甲醇∶水(53∶35∶12);流速:1.5mL/min;检测波长:245 nm;进样量:20μL。

1.4.2 标准曲线制作 精密称量伊维菌素对照品用甲醇溶解并定容成880μg/mL储备液,倍比稀释后得标准工作液(27.5～880μg/mL)进 HPLC测定,以峰面积对浓度绘制标准曲线。

1.5 吡喹酮含量检测方法

1.5.1 色谱条件 紫外检测器;色谱柱:Intertsil C18柱(5 μ m,250 ×4.6 mm,DIKMA 公司);流动相:甲醇∶水(97∶3);流速:1.0mL/min;检测波长:263 nm;进样量:10μL 。

1.5.2 标准曲线制作 精密称量吡喹酮对照品用甲醇溶解并定容成为5.9 mg/mL储备液,稀释后得标准工作液(0.118～5.9μg/mL)进 HPLC测定,以峰面积对浓度绘制标准曲线。

1.6 回收率试验 配方中伊维菌素和吡喹酮含量分别为0.25%和6%,回收率试验时分别在空白注射液(不含伊维菌素和吡喹酮的空白制剂)中添加伊维菌素和吡喹酮至配方浓度。

1.7 样品前处理 制剂样品和添加样品的前处理方法相同,具体步骤如下:将样品摇匀,用移液管取出2mL样品于25mL容量瓶内,用甲醇溶解,定容,微孔滤膜过滤,进样。

1.8 稳定性试验

1.8.1 光加速试验 取复方注射液3批样品,置照度为4500±500 Lx的条件下放置10 d,分别于5 d、10 d定时取样,考察样品外观色泽、含量、澄明度、降解产物、不溶性微粒等指标。

1.8.2 温湿加速试验 取3批制剂样品,在温度40℃±2℃,相对湿度 75%±5%的条件放置6个月。每月取样1次,考察样品外观色泽、含量、澄明度、降解产物、不溶性微粒等指标。

2 结果与分析

2.1 复方注射液的研制

2.1.1 溶剂体系筛选结果 试验结果显示,吡喹酮在丙二醇、吡咯烷酮、二甲基甲酰胺等溶剂中溶解度较高,但吡喹酮经吡咯烷酮溶解后易出现变色反应;伊维菌素在有机溶剂中极易溶解,但用聚乙二醇、无水乙醇、甘油等溶解后易出现结晶或雪花状沉淀。经反复多次筛选,最终确定丙二醇和二甲基乙酰胺按适宜比例的混合溶剂体系可达到较理想的溶解效果。

2.1.2 助剂筛选结果 筛选结果表明,本制剂的适宜抗氧化剂和止痛剂分别为二叔丁基羟基甲苯和利多卡因。若选用叔丁基羟基茴香醚为抗氧剂,所制得样品易出现变粉现象,而用生育酚为抗氧化剂则因其出峰时间与吡喹酮出峰时间有重叠,分离效果差。利多卡因被选为本制剂的最终止痛剂的优势是刺激性较小且溶解性能极好,同时不影响吡喹酮的分离效果。

2.1.3 正交试验结果 数据用最大极差法处理,结果显示,最佳配方组合是抗氧化剂为0.2%、止痛剂为0.9%的配方。从两者的极差值(R值)可知,抗氧化剂(R=0.49)和止痛剂(R=0.41)对制剂质量的影响差别不大,但抗氧化剂的水平对制剂质量的影响稍大些。

2.2 制剂药物含量检测方法 制剂中伊维菌素和吡喹酮的含量检测方法在其相应的浓度范围内均呈良好线性关系,线性方程分别为Y=26609.64X+75675.17(r=0.9999)和Y=829000X+16500(r=0.9998)。3批伊维菌素添加样的回收率分别为89.1%、93.6%、102.4%,变异系数为 3.5%;3批吡喹酮添加样的回收率分别为95.2%、99.3%、103.3%,变异系数为4.1%。

2.3 稳定性试验结果

2.3.1 光加速试验结果 光加速试验结果见表2,在强光照射前三批复方注射液均为无色澄明液体,经强光照射10 d,样品的澄明度无明显变化,但3批样品的色泽在第5天时变为淡黄色,至第10天时3批样品均变为深黄色。制剂中的药物含量亦有部分下降,但仍在规定范围内,其中伊维菌素和吡喹酮的含量下降范围分别在3.6%和2.9%之内。

表2 复方注射液光加速试验结果 (实测量/标示量,%)

2.3.2 温湿加速试验结果 温湿加速试验结果见表3,在温湿加速试验前后,3批复方注射液均为无色澄明液体,外观色泽和澄明度均无明显变化。虽然制剂中药物含量有所下降,但均在允许范围内,其中伊维菌素和吡喹酮的下降范围分别为5.2%和3.2%之内。

表3 复方注射液温湿加速试验结果 (实测量/标示量,%)

3 讨论

3.1 关于复方注射液的研制 当今市场上虽已有一些国外伊维菌素和吡喹酮复方制剂,但均为口服制剂,生物利用度低;国内于咏兰[4]亦曾研制了伊维菌素和吡喹酮复方混悬液,但混悬注射液不易注射,且具较大刺激性。为克服上述不足之处,本文经反复多次试验,成功筛选出适宜的溶剂体系及理想的抗氧化剂和止痛剂,研制出工艺简单、操作方便、刺激性小的伊维菌素和吡喹酮复方注射液,为兽医临床提供了一种理想的防治动物寄生虫混合感染的抗寄生虫复方制剂。

3.2 关于制剂中药物含量检测方法 因本制剂中辅料成分较多,且吡喹酮因极性小而出峰时间早[5-6],因此建立制剂中药物含量检测方法的难点在于如何将伊维菌素和吡喹酮与制剂中辅料成分成功分离。本文以《中华人民共和国兽药典》(2005年版)为基础,查阅国外相关文献[5-8]后成功建立了制剂中伊维菌素和吡喹酮含量的HPLC检测方法。本文建立的方法具有如下优点:①样品前处理方法简单,且样品处理后48 h内仍具有极好的稳定性;②分析时间短(每个样品都可以在20 min之内完成分析)。由于本制剂是伊维菌素和吡喹酮复方制剂,如能建立同时检测制剂中两药含量的方法将大大减少工作量,因此,本实验室现正在摸索两药同时检测的方法。

3.3 关于制剂的稳定性 本制剂在强光照射第5天时开始有变色现象,虽然制剂澄明度无明显变化,且制剂中伊维菌素和吡喹酮的含量下降仍在规定范围内,但为保证产品质量,本制剂宜避光保存。温湿加速试验显示,本制剂在温度40℃±2℃,相对湿度75%±5%条件下放置6个月后其外观色泽和澄明度均无明显变化。虽然制剂中药物含量有所下降,但均在允许范围内,结果表明,制剂在恒温恒湿条件下放置6个月稳定性良好。目前长期稳定性试验正在进行中,制剂的有效期最终将结合湿温加速试验结果和长期稳定性试验结果确定。

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