母猪群发性晚产死胎病因分析

周玉龙,石忠鹏,耿 晶,陈永松,吕其林,刘 辉,张晓磊,吴 凌,朴范泽

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江 大庆 163319;2.黑龙江省嫩江县九三分局山河农场兽医院,黑龙江 嫩江 161421)

黑龙江省肇东市某猪场存栏生产母猪50头,于2009年10月,同期生产的15头母猪均出现产期滞后2～3 d,产死胎。母猪未见任何异常症状,而且死亡的胎儿也未见木乃伊化以及畸形等病理变化,但是剖检时发现流产胎儿心脏、脾脏、肾脏和膀胱黏膜等器官有散在的出血点。为了确诊该猪群暴发流产的病因,我们进行了常规的细菌学检验,而且应用PCR方法对常见的能够引起母猪发生流产的猪瘟病毒(CSFV)、呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)和细小病毒(PPV)进行了检测,结果确诊猪瘟病毒是引起本次发病的主要原因,关于繁殖障碍型猪瘟引起猪群发生全部以晚产为特征的病例报道极少,因此本研究对猪瘟的临床诊断具有重要的借鉴意义,我们将有关试验报告如下。

1 材料

1.1 主要试剂与培养基 T rizol(Invitrogen),AMV反转录酶和Taq DNA聚合酶(MBI),RNase Inhibitor、dN TP 和 DL-2000 Marker(TaKaRa)。按常规方法制备血液营养琼脂培养基[1]。

表1 CSFV、PRRSV、PPV和PRV的PCR检测引物

1.2 引物 参照已有的研究报道合成特异性的CSFV、PRRSV、PPV和PRV 寡核苷酸引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 病料 无菌采取发病母猪新流产的胎儿肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结,置-70℃备用。

2 方法

2.1 细菌的分离鉴定 将无菌采集的流产胎儿肝脏、脾脏和肺脏分别接种到含有新鲜的5%绵羊血液营养琼脂培养基,进行常规细菌分离培养(需氧培养和厌氧培养)[1]。

2.2 病毒检测

2.2.1 CSFV和PRRSV检测

2.2.1.1 组织总RNA提取 取约200 mg脾脏、肺脏和淋巴结分别在研钵中加入液氮研磨,按照1 m L T rizol/100 mg组织,按产品说明书进行RNA的提取,提取的RNA置核酸真空浓缩仪内10 min,烘干后溶于30μL DEPC水中,放置-70℃待用。

2.2.1.2 cDNA合成与RT-PCR反应 模板RNA 10 μL,寡核苷酸 oligod T 1 μL,70℃5 min,置于冰上2 min,加入5×RT Buffer 4μL,10 mmol/L dNTPs 2 μL,40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL,混匀瞬离,37℃ 5 min后加入 5U/μL AMV Reverse T ranscriptase 1μL 42℃2.5 h,70℃10 min放于冰上待用。

PCR反应体系(25μL):Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0μL,25μm ol/m L引物 P1和P2各 0.5μL,5 U/μL LA Taq DNA 聚合酶 0.125 μL,无菌去离子水 16.9μL,模板 DNA 0.5μL。

PCR反应条件:94℃预变性5 min,进行30个循环(94 ℃30 s、50 ℃40 s、72 ℃1 min),72 ℃延伸10 min,最后降温至4℃结束[2]。

2.2.2 PPV和PRV的检测 按照常规方法从采集的病料肝脏、肺脏和淋巴结中提取组织DNA[4]。以提取的组织 DNA为模板,按照文献报道进行PPV和PRV的双重PCR扩增。反应体系为25 μL,反应程序为:94℃预变性10 min,进行30个循环(94 ℃40 s、55℃40 s、72 ℃1 min),72 ℃延伸10 min[3]。

3 结果

3.1 细菌分离结果 在需氧、厌氧和微需氧条件下,从流产胎儿的肝脏、脾脏和肺脏内均未分离出细菌。

3.2 CSFV和PRRSV检测结果 进行RT-PCR扩增后,PCR产物用1.0%琼脂糖进行凝胶电泳后在凝胶成像系统中观察,可见到288 bp的基因条带,大小与CSFV预期基因相符(见图1)。

3.3 PPV和PRV检测结果 将PCR扩增产物用1.0%琼脂糖进行凝胶电泳,结果未见到目的基因条带出现。

4 小结与讨论

根据流行病学特点、临床症状、剖检病变,以及应用RT-PCR检测到288 bp的CSFV基因片段,最终确诊该猪群暴发的流产是由CSFV引起的。

图1 RT-PCR扩增结果

近些年,关于猪群发生慢性猪瘟的报道越来越多,能够引起慢性猪瘟的原因比较多,像猪瘟疫苗剂量应用不当及对猪瘟疫苗运输、保存、注射操作、疫苗稀释剂使用等方面的不规范,疫苗质量下降或失效;免疫抑制疫病干扰猪群,感染有蓝耳病、圆环病毒病、伪狂犬病、喘气病等疾病,或是使用了霉变劣质饲料,使机体免疫系统受到破坏,免疫力下降,即便使用猪瘟苗也难以起到完全保护作用[5];消毒防疫意识淡薄,猪群中有持续感染的带毒母猪长期散毒,为猪瘟病毒繁殖与传播提供了机会[6];不实行全进全出制度,对购入的猪苗的健康背景不明,易造成猪瘟交叉感染,同时发现病猪不及时隔离消毒,给猪瘟传播提供便利。除了上述原因以外,另一个不容忽视的原因是猪瘟免疫程序不合理,免疫过频时,体内仍有高水平的抗体时就接种而发生中和,其次免疫密度过低,一般猪瘟疫苗接种必须半年1次[7]。该猪场是2006年建立,最初在母猪产后7 d接种猪瘟疫苗,自2009年起,免疫程序更改为母猪产后30 d接种猪瘟疫苗(与仔猪同期免疫),现在主要是更改免疫程序的母猪发生流产,因此推断该猪场发生慢性猪瘟流产的原因可能是更改免疫程序后造成免疫紊乱所致。可见,对于猪瘟的预防应该在科学的抗体监测基础上,制定合理的免疫程序至关重要。

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