白背毛木耳杂交育种及杂交子选育*

冀 宏，刘 萍，朱 清，姚璐晔，徐 兵

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

白背毛木耳 （Auricularia polytricha）隶属于担子菌亚门、层菌纲、木耳目、木耳科、木耳属中的毛木耳种[1]。毛木耳为著名的食药兼用真菌，质脆滑爽，被誉为 “树上海蜇皮”，目前国内和东南亚市场需求与日俱增。国内白背毛木耳栽培技术和品种均源自台湾省，由于种质单一，经过多年的生产，菌种呈现性状退化趋势，加快选育优良性状新品种是相关技术研究所关注的主要方向[2，3]。对异宗结合食用菌来说，目前育种研究应用普遍，同时也最具成效的方法是杂交育种技术，经过有性繁育培养的菌种，则有可能在各方面表现出优于亲本的良好性状[4－7]。该技术的关键是有性单孢子收集和杂交子鉴定。白背毛木耳是异宗结合的四极性菌类，每个担子上通常有4个担孢子[1]，通过试验可以获得毛木耳有性单孢子[8]。同工酶分析作为化学分类的重要指标应用于真菌的分类鉴定中，是菌株分类鉴定和亲缘关系研究的重要手段。酯酶是一种食用菌中存在较普遍的酶，其同工酶谱又具有较高的多型性，因而特别适于作为杂种鉴定的指标[9]。采用酯酶同工酶分析鉴定毛木耳杂交子是最为真实可靠的方法。

白背毛木耳生产已成为江苏省丰县农业经济的特色产业。由于生产模式粗放，近年来菌种退化严重。本研究旨在通过单孢子收集、菌丝体融合、酯酶同工酶分析的杂交育种方法，对产区主打生产品种 “丰2”进行优化改良，获得更加适合当地资源环境条件的性状优良的杂交子，为白背毛木耳区划良种选育提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试品种

江苏丰县师寨镇白背毛木耳产区主流品种 “丰2”。

1.1.2 主要试剂

葡萄糖、牛肉膏、维生素B1、磷酸二氢钾、硫酸镁、过硫酸铵、蔗糖、Tris、TEMED、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、Acr、Bis、甘氨酸、乙酸－1－萘酯、乙酸－2－萘酯、固兰RR盐、丙酮、乙酸、溴酚蓝，上述试剂均为分析纯，由中国医药集团上海化学试剂有限公司提供。豆粕、麦麸、玉米粉、马铃薯等为市购。

酯酶同工酶电泳的试剂配制参照NY－T 1097－2006[7]。

1.1.3 培养基

PDA 培养基： 马铃 薯 20 g·100－1·mL－1、 葡萄 糖 2 g·100－1·mL－1、 琼脂 2 g·100－1·mL－1， pH 自然液体培养基：马铃薯 20 g·100－1·mL－1、 玉米粉 3 g·100－1·mL－1、 葡萄糖 2 g·100－1·mL－1、 蛋白胨 0.2 g·100－1·mL－1、 磷酸二氢钾 0.2 g·100－1·mL－1、 硫酸镁 0.1 g·100－1·mL－1、 维生素 B1（10 mg·100－1·mL－1）、 酵母粉 0.5 g·100－1·mL－1， pH 自然

栽培培养基 （木屑麦麸培养基）：木屑73%、麦麸25%、糖1%、碳酸钙1%，含水量65%。

1.2 仪器与设备

EL104电子天平，梅特勒－托利多上海仪器有限公司；S－SW－CJ－2F超净工作台，上海博泰实验设备有限公司；HYG－A全温摇瓶柜，太仓市博莱特仪器厂；303型智能人工气候培养箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；光学显微镜，江南光电股份有限公司；3K30高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；1000μL移液枪，英国吉尔森公司；DYCZ－24DN型垂直板电泳槽，北京六一仪器公司；显微镜图像分析系统，上海精天电子仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子收集

采用钩悬法收集单孢子。方法如下：无菌操作将耳片用无菌水洗涤，无菌纱布吸干，切成大小合适 （以不碰触三角瓶口、壁为宜）的块状，取灭菌回形针，一端钩住耳片，另一端钩在三角瓶口上 （瓶内事先注入厚1 cm灭菌PDA培养基），加中性硅胶塞封口，试验设置若干组，置26℃培养，取出瓶内耳片后，继续培养，观察瓶底部培养基孢子萌发情况。

将孢子萌发形成的单菌落挑至斜面培养基中编号培养，待菌丝满管，于4℃条件下保藏。

1.3.2 单核菌丝筛选

无菌操作挑取上述培养菌丝体制成水封片，置于高倍显微镜下观察，无锁状联合且菌丝细弱者即为单核菌丝，确认后标记为杂交亲本。

1.3.3 杂交组合设计

实验采用单核菌丝杂交育种进行种内杂交 （两点法）。在同一平板培养基 （直径90 mm）上相距1.5 cm，分别接种不同单孢子萌发的单核菌丝，26℃恒温培养。

1.3.4 杂交子鉴别

1）镜检锁状联合

挑取杂交组合相交部位的菌丝，制成水封片，置于40×10倍显微镜下观察锁状联合结构。

2）拮抗实验

采用三点法在平板培养基中分别接入亲本和杂交子，26℃培养观察并记录实验结果。

3）酯酶同工酶电泳法鉴定杂交子

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳法[10－12]。

（1）样品制备

菌丝体培养：采用1.1.3中的液体培养基，无菌条件下接种试管斜面菌丝体，静置24 h后置于摇床中，温度26℃， 220 r·min－1条件培养， 培养时间为 5 d。

收集菌丝球，40℃烘干。分别称取0.5 g菌丝球、0.5 g石英砂，将样品提取液1 mL放于研钵中冰浴研磨，4℃，10000 r·min－1离心10 min，取上清液，将上清液、蔗糖、溴酚蓝按 （体积比）5∶1∶1混合制成样品液 （研磨离心后的样品须当天使用）。

（2）凝胶制备

分离胶：将分离胶缓冲液、分离胶贮液、蒸馏水、过硫酸铵，按体积比1∶2∶2∶4比例混合均匀，用移液枪加入电泳槽中至距短板上沿3 cm处，并封上适量蒸馏水，使分离胶液面平行。待胶聚合后用吸水纸小心将水分吸尽。

浓缩胶：将浓缩胶缓冲液、浓缩胶贮液、核黄素溶液、蔗糖溶液按1∶2∶1∶4的体积比混合均匀，灌入胶室，立即插好样品梳，日光灯下聚合。

（3）点样

浓缩胶聚合后缓慢去除样品梳，吸去点样孔中多余水分，上槽、下槽加好电极缓冲液后，用50μL微量进样器吸取样品20μL插入样品槽底部，缓慢注入。

（4）电泳

将电泳槽和电泳仪相连，打开电源，平放于冰箱内，连接电源，上槽为负极，下槽为正极。电泳在4℃冰箱中进行。指示剂在浓缩胶位时，电压180 V，待指示剂进入分离胶后，电压增至210 V，电泳采用稳定档。当指示剂迁移至距胶板下缘2 cm左右时停止电泳。

（5）染色及固定

电泳完毕将凝胶立即转移至染液中，直至出现褐色条带，蒸馏水冲洗数次，置于固定液中固定。

（6） 结果计算

置于凝胶成像系统 （76S/07969，Biorad）下拍照，计算迁移率 （Rf） 和相似系数 （Se）。

实验以 “丰2”亲本双核菌丝与杂交子菌丝进行酯酶同工酶谱分析对照，以鉴定杂交子真实性。

1.3.5 杂交子出耳试验

杂交子出耳试验在人工气候箱内进行，以亲本 “丰2”为对照，观测杂交子结实能力及生产性状。

2 结果与分析

2.1 孢子收集及单核菌丝筛选结果

钩悬法结果显示，26℃静置3 d，可见瓶内培养基上形成一个雾状孢子印。无菌操作把悬挂瓶内的耳片取出，26℃继续培养，经过3 d～4 d，孢子萌发，在培养基表面就会出现许多浅白色菌落 （图1）。无菌挑取单孢子菌落（最好挑取瓶壁上的单个菌落）转接至试管斜面培养基，26℃恒温培养。

挑取试管斜面菌丝制成水封片，置于显微镜下观测，无锁状联合且生长细弱的菌丝即为单核菌丝 （图2），保存并作为杂交材料。

2.2 杂交实验结果

试验共设置169对单核菌丝×单核菌丝随机杂交组合。选取部分可亲和杂交组 （目测）见表1。

图1 单孢子萌发形成小菌落

图2 显微镜下的单核菌丝（40×10 倍）

表1 单核菌丝杂交组合可亲和组

2.3 杂交子鉴定结果

观察各杂交试验组发现，部分菌落相交部出现了明显的沟状拮抗，镜检此区域菌丝未发现锁状联合，则认为试验组杂交不亲合；而部分组合相交部位微微隆起形成明显菌丝线 （图3），镜检此区域菌丝发现锁状联合，即认为试验组杂交亲合，对选定的杂交组合进行锁状联合镜检和亲本拮抗实验初筛，最后经酯酶同工酶电泳确定杂交子。

2.3.1 镜检锁状联合

杂交成功则菌丝为双核体，镜检可观察到锁状联合，见图4。

图3 单核4与16杂交菌落形态

图4 杂交组合的锁状联合（箭头所指 40×10倍）

镜检表1各杂交组合菌丝，只有22×4、22×16、4×16杂交组合出现锁状联合，且菌丝强壮，活力旺盛，初步认为是杂交子 （双核菌丝）。

2.3.2 拮抗实验结果

杂交株与亲本株的拮抗试验是较为实用的鉴定方法。试验系统显示，杂交菌株至少对亲本株之一呈明显的拮抗性，有些则对双亲株均呈现拮抗反应，拮抗表现的多样性反映着杂交子变异程度的不同[13]。杂交组合镜检及亲本拮抗试验结果见表2。

将上述杂交子与亲本 “丰2”进行两点培养，结果显示杂交组合22×4、4×16与亲本出现明显拮抗线，其余组合与亲本拮抗不明显，初步确认试验组22×4、4×16为杂交子。在此基础上，进行酯酶同工酶谱分析，进一步验证杂交子真实性。

表2 杂交组合镜检及亲本拮抗试验结果

2.3.3 酯酶同工酶谱分析结果

酯酶同工酶电泳酶带的位置是由编码各酶带的基因直接决定的，所以通过观察酶带的条数、位置、宽度和染色深浅，可判断杂交子与亲本的基因组异同[14，15]。下面仅以杂交组合4×16为代表，说明本试验酯酶同工酶谱分析的方法与结果。

图 5和图 6分别为亲本 （“丰 2”） 和杂交子 （4×16）酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱及其模式图。

图5 亲本酯酶同工酶图谱及模式图

图6 杂交子酯酶同工酶图谱及模式图

由图5、图6可以看出 “丰2”有6条酶带，杂交组合4×16有7条酶带，两者共有的条带数为5条。 “丰2”特有条带1条，迁移率为0.885，杂交组合特有条带2条，迁移率分别为0.318、0.602。由于酶带的位置是由编码各酶带的基因直接决定的。所以可以知道这两个菌株的基因组是不一样的。同时从图上也可以看出酶带的宽度和颜色深浅不同，这表明酶的活性和含量也是不同的[14]。

计算亲本与杂交子之间的相似系数Se，以 “丰2”作为标准样品，计算公式为：

式中：Se表示被检样品和标准样品二者间相似系数；Sxy表示被检样品和标准样品二者间共有酶带数；Sx表示标准样品特有酶带数；Sy表示被检样品特有酶带数。

相似系数表明了两者之间的亲缘关系，从结果可以看出来两个菌株的遗传特性是有明显差别的。因此可以得出这样的结论，杂交组合4×16是不同于亲本 “丰2”的新菌株。

2.4 杂交子出耳试验结果

为考察杂交子生长、结实、产量等生产性状，在相同条件下，以亲本为对照进行了杂交子料袋出耳试验。试验在人工气候箱中完成。结果表明杂交子不仅具有结实能力，且生长优势较明显。杂交子及亲本生长活力比较试验结果见表3。

表3 杂交子及亲本生长活力比较试验结果

表3满袋时间和菌丝生长速度充分显示，杂交子4×16生长活力较亲本旺盛；然而， “丰2”接种固体培养基后对栽培料适应性较强，萌发最快，说明在生产应用中可以通过培养基优化，进一步提升杂交子生产性能。杂交子4×16、22×4与 “丰2” 出耳试验结果见图7、 图8。

图7 杂交子4×16与 “丰 2”出耳试验结果

图8 杂交子22×4与 “丰 2”出耳试验结果

图7、图8说明，杂交子具有良好的结实性能，且在相同条件下，2组杂交子均表现出现蕾快、耳片生长快的优势特征；从子实体形态性状考察，杂交子4×16的耳片舒展、厚实、圆整，较杂交子22×4更优。

综上结果，杂交子4×16实验室生产性状优势显著，具备白背毛木耳优良新品种开发潜力。

3 结论与讨论

本实验说明，利用单核菌丝进行白背毛木耳种内杂交育种方法可行。杂交子4×16表现出优于亲本的良好生产性状，经过生产适应性驯化，极可能成为性状优良的白背毛木耳生产新品种。

进行杂交子鉴定时，要将镜检锁状联合、亲本拮抗实验、酯酶同工酶电泳图谱分析相结合，才具有较高的可信度。

拮抗试验结果只能作为判定杂交亲和性的部分依据。本实验挑取杂交子时发现，虽然单核菌落间有隆起的生长线 （常规判断为拮抗线），但取此区域菌丝镜检却分明看到锁状联合，显示杂交成功。这种情况虽然具有实际应用价值，但尚需探讨其理论机制。

在实际操作过程中，酯酶同工酶电泳技术仍存在温度条件难控制，酶活性不稳定等问题[16]。本实验中发现，白背毛木耳酯酶同工酶的种类和酶活性与菌丝球的液体培养时间有关，培养时间越长酶谱中酶带颜色越深 （酶活性越强），因此，电泳条件的控制和一致性是极为重要的。

[1]吕作舟.食用菌栽培学[M].北京：高等教育出版社，2006.

[2]黄毅.现代食用菌栽培理论与实践[M].厦门：厦门大学出版社，1996.

[3]王谦，尹红芳，蔡喜存，等.毛木耳菌丝体的营养生长条件[J].河北大学学报， 2007， 27(5)： 521－524.

[4]陈娟，苏开美.食用菌遗传育种及种质鉴定研究进展[J].中国食用菌， 2008， 27(5)： 3－8.

[5]马三梅，王永飞，亦如瀚.食用菌育种的研究进展[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2004，32(4)：108－112.

[6]桂明英，王刚，郭永红，等.食用菌育种技术的研究进展[J].食用菌， 2005(5)： 3－5.

[7]张丹，高健伟，郑有良，等.毛木耳种质资源的酯酶同工酶分析[J].生物技术通报， 2006(2)： 483－488.

[8]何培新，申进文，罗信昌，等.木耳孢子单核菌株培养性状多态性研究[J].食用菌学报，2003，10 (2)：1－4.

[9]高健伟，张丹，王波，等.毛木耳优良菌株的筛选[J].中国食用菌， 25(1)： 18－19.

[10]NY－T 1097－2006，食用菌菌种真实性鉴定 酯酶同工酶电泳法[S].

[11]王波，甘炳成，彭卫红.黄背毛木耳菌株酯酶同工酶与产量比较分析[J].食用菌，2007(3)：8.

[12]胡能书，万贤国.同工酶技术及其应用[M].长沙：湖南科学技术出版社，1985.

[13]戴秉丽.原生质体技术在食用菌育种中的应用研究[J].中国食用菌， 1995(6)： 17－19.

[14]刘庆，徐兴华.电泳法分析食用菌酯酶同工酶方法的优化[J].生命科学仪器， 2008， 6(5)： 42－43.

[15]杨立红，辛晓林，蔡德华，等.酯酶同工酶在食用菌菌种选育中的应用研究[J].中国食用菌，2004，23(5)：10－12.

[16]刘日新.食用菌的研究与利用[J].中国食用菌，1997，17(4)：5－7.