血红素加氧酶1对猪瘟病毒复制的影响

史子学，杨 知，曲 会，李江南，朱 妍，郭焕成，涂长春*

(1.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春130062；2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130062)

猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)是有囊膜的单股正链RNA病毒，与牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)和牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)、绵羊边界病病毒(BDV)共同属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员[1]。此外，报道瘟病毒还有一些暂定种，如长颈鹿瘟病毒[2]。

近几年研究病毒和宿主相互作用是阐明病毒致病机理的一个热点，迄今关于CSFV进入细胞、复制、出芽和释放的机制仍知之甚少。早期报道的关于瘟病毒入侵猪肾细胞(SK6)的两步感染机制为：首先，病毒的Erns蛋白和细胞表面受体粘附，随后，病毒E2蛋白和细胞表面特异性的受体结合进入细胞[3-4]。在这个机制中涉及的CSFV E2是最主要的产生中和抗体的病毒糖蛋白，能诱导猪保护性免疫反应[5-7]。E2是Ⅰ型跨膜糖蛋白具有介导病毒进入细胞的功能[8]，在CSFV基因组中如果E2蛋白编码基因突变、完全缺失或被替换，会导致病毒失活或细胞嗜性改变[9-10]，证明E2在CSFV感染过程中发挥重要作用。本实验室前期对CSFV感染猪外周血白细胞(PBL)蛋白质组学研究发现，CSFV感染能诱导PBL血红素加氧酶 1(Heme oxygenase 1，HO-1)mRNA表达升高4倍[11]。HO-1是一个与微粒体和胞质内催化位点相关的膜结合蛋白。HO-1是亚铁血红素代谢的限速酶，它将亚铁血红素分解成胆绿素、一氧化碳(CO)和游离铁离子[12]。细胞的HO-1具有细胞保护作用，抑制抗氧化应激[13]、抗炎症[14]、抗增殖[15]和抗凋亡特性[16-17]。然而，HO-1对病毒复制的影响尚未见报道，HO-1的上述功能是否也会影响CSFV感染细胞的分子机制还不清楚，有必要深入研究HO-1在CSFV感染细胞中的作用。为此本实验对HO-1影响CSFV细胞中复制的相互作用机制进行了研究。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞和抗体 CSFV石门株血毒(105.0TCID50/0.1 mL)、PK-15细胞以及CSFV阳性和阴性血清均为本实验室保存。

1.2 主要试剂 AMV反转录酶和dNTP购于Promega公司；SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购于TaKaRa公司；细胞凋亡检测试剂盒购于ACTGene公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔和FITC标记的兔抗猪IgG购自Sigma公司；鼠抗β-actin单克隆抗体(MAb)购于Abcam公司、羊抗猪HO-1多克隆抗体购于Santa Cruz公司。

1.3 特异干扰HO-1 siRNA分子设计及合成 使用Dharmacon在线设计软件设计猪HO-1基因特异性的siRNA干扰序列，siHO-1：5'-AAGGACAUUAUUUCGGACACA-3'；并以siHO-1随机打乱序列作为对照，siControl：5'-ACACGAGAUAAUAUCGACUUG-3'。siRNA双链干扰分子5'端两个AA，3'端两个UU，经NCBI blast分析合成的干扰序列与猪HO-1以外的基因同源性小于50%，对照序列与猪基因组所有序列同源性小于60%。

1.4 siRNA分子转染细胞 待细胞生长满培养板底的80%～90%时，将siRNA分子用Roche FuGENE HD试剂转染到PK-15细胞中，操作过程按说明书。同时设转染对照干扰序列样品(siControl)、Mock(加转染试剂，无siRNA干扰分子)、空白(不加转染试剂，无siRNA干扰分子)细胞对照。

1.5 siRNA转染细胞接毒及样品收集 PK-15细胞转染siRNA分子后24 h接种CSFV，接种剂量1×103TCID50/孔(6孔板)。在接种病毒后第24 h、48 h、72 h收取细胞样品分别进行western blot和TaqMan荧光定量RT-PCR[11]检测；同时，收集细胞培养上清和细胞样品测定CSFV TCID50。测定CSFV TCID50方法为：吸净孔板中细胞培养液，另加0.5 mL无血清无抗生素MEM，刮下培养板中的细胞收集于离心管中。冻融3次充分释放病毒，离心收上清测病毒滴度；收取细胞培养上清检测CSFV TCID50前离心弃细胞碎片。

1.6 Western blot检测HO-1干扰效果 提取实验方法1.5中培养于6孔板中接毒后24 h、48 h、72 h细胞样品蛋白进行SDS-PAGE、转膜和western blot检测细胞中HO-1和β-actin表达。将PVDF膜分别与β-actin MAb、羊抗猪HO-1抗体室温孵育2 h。用PBST洗涤4次，每次15 min，分别用HRP标记的兔抗鼠和兔抗羊IgG(1∶10 000倍稀释)室温反应2 h，PBST洗涤4次，每次15 min。化学发光法显示结果，X-ray胶片暗室曝光，扫描仪扫描。

1.7 统计学分析 用TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测处理后CSFV基因组，用SPSS 11.0软件进行统计学分析，数据以平均值±标准差(X±SD)表示，组间比较采用t检验。以P值表示统计学差异，p<0.05表示差异有统计学意义。

1.8 病毒感染后不同时间的感染滴度测定 PK-15细胞按1.0×104细胞/孔传代于96孔细胞培养板，于37℃5%CO2培养24 h。将实验方法1.5中收取的24 h、48 h、72 h细胞和培养上清样品作 10-1、10-2、10-3、10-4和10-5稀释，测定病毒滴度，用Karber公式计算病毒TCID50。3次重复实验计算平均值，数据进行统计学分析。实验中设立CSFV阴性血清对照。

1.9 PK-15细胞凋亡检测 收集实验方法1.5中培养于6孔板中24 h、48 h、72 h的细胞，参考ACTGene凋亡试剂盒说明书检测细胞凋亡，然后BD FACSCalibur检测。以未标记的正常白细胞设门，分别单标记Annexin V-FITC、PI染料的细胞调节荧光补偿，FACS设置的检测细胞数量为10 000个。

2 结 果

2.1 CSFV感染上调PK-15细胞中HO-1表达用western blot方法分析结果表明，PK-15细胞感染CSFV后，HO-1蛋白在24 h、48 h和72 h呈表达升高的趋势。而正常PK-15细胞中HO-1表达无明显变化。内参蛋白β-actin在感染病毒和正常PK-15细胞中保持恒定(图1)。

2.2 HO-1 siRNA分子干扰效果 利用siRNA的方法沉默PK-15细胞HO-1的表达。Western blot检测表明，转染siRNA后48 h、72 h，细胞中HO-1蛋白表达显著下降(图2)。

2.3 下调HO-1表达抑制CSFV复制 PK-15细胞转染HO-1 siRNA后细胞接种CSFV，在不同时间提取感染细胞的RNA，用病毒5'-UTR基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测。结果表明，接种病毒后48 h和72 h细胞中 CSFV基因组显著低于 siControl、Mock和未处理细胞对照组(p<0.05)(图3)。

2.4 下调HO-1表达影响病毒滴度 分析HO-1沉默后PK-15细胞中CSFV在不同时间增长滴度发现，不仅干扰HO-1表达的PK-15细胞中病毒基因组复制受到抑制(图3)，而且病毒感染细胞和培养上清中滴度变化也出现类似趋势(图4)。接种病毒后不同时间无论是细胞中还是细胞培养上清中，干扰HO-1表达组和对照组之间差异显著(p<0.05)。

2.5 下调表达HO-1对细胞凋亡的影响 用FITC-Annexin V和碘化丙锭(PI)细胞凋亡检测试剂盒分析发现，干扰PK-15细胞中HO-1表达后接种CSFV并没有引起PK-15细胞发生明显的细胞凋亡(与正常PK-15细胞及未干扰HO-1组PK-15细胞接种 CSFV 相比)，p>0.05(图 5)。

3 讨 论

HO-1在机体组织器官中广泛存在，能够被各种物质和外源刺激诱导，例如，亚铁血红素、重金属、炎性细胞因子、UV照射和氧化亚氮等[18]，并且氧化亚氮被认为是最有效的刺激物[19]。HO-1具有抗氧化、抗凋亡、抗炎症等功能，另一个功能是调控减少一些粘附分子，如E-selectin或P-selectin的表达[20]。但目前尚没有关于HO-1是否在病毒感染细胞过程中发挥作用的研究。本实验研究证明在PK-15细胞模型中HO-1是一个和CSFV相互作用的新蛋白，HO-1对CSFV病毒在细胞中的复制有重要影响。用siRNA抑制PK-15细胞中HO-1蛋白表达后再接种CSFV，病毒基因组和对照组相比显著降低。在HO-1下调的PK-15细胞模型中，接种CSFV后细胞和细胞培养上清中病毒的滴度也显著降低。然而，鉴于实验结果有限性，阐明HO-1影响CSFV细胞中复制的具体机制仍需要深入的研究。

HO-1具有抗凋亡特性[21]，然而干扰PK-15细胞中HO-1表达后，在接种病毒细胞或未接种病毒细胞中没有发现明显的细胞凋亡现象。表明干扰PK-15细胞中HO-1这一抗凋亡功能的蛋白表达后不会引起细胞凋亡，即使再接种CSFV仍然不会引起细胞凋亡发生。虽然有报道证明用DNA laddering或检测凋亡蛋白的方法检测到CSFV感染诱导免疫系统细胞凋亡，但建立的细胞系如PK-15、SK6还没有发现感染CSFV后会发生凋亡。这也强调了CSFV感染引起的细胞凋亡与选择的靶细胞有关，而且体内和体外实验也存在差别。

总之，本研究首次报道了细胞HO-1对CSFV细胞中复制的影响，初步鉴定了HO-1是一个与CSFV存在相互作用的新蛋白，为下一步深入研究其和病毒蛋白作用机制奠定了基础。

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