Asia 1型口蹄疫病毒VP1基因的表达鉴定及其多抗制备

朱远茂，任宪刚，史鸿飞，高欲燃，于 作，冯军科，相文华*，薛 飞*

(1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001；3.哈药集团生物疫苗有限公司，黑龙江哈尔滨150030)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)感染偶蹄动物所引起的急性、接触性传染病[1]。FMDV有7个血清型，即A、O、C、亚洲Ⅰ型(Asia 1)和南非Ⅰ(SAT1)、SAT2、SAT3[2]。Asia 1 FMDV于1954年分离于巴基斯坦，我国于1958年在云南省首次发现Asia 1 FMD。给我国的养殖业造成了巨大的损失[3]。FMDV结构蛋白VP1是主要免疫原性蛋白，能够诱导动物机体产生较高水平的抗体从而保护机体免受FMDV攻击[4]。人工合成的Asia 1型FMDV第133位～163位的多肽能够刺激豚鼠产生高水平的中和抗体[5]。在FMDV基因工程苗的研制、诊断方法的建立等领域，VP1蛋白是被关注的热点[6]。

本研究利用原核表达系统进行Asia 1 FMDV VP1结构蛋白的表达，并制备多克隆抗体，对于FMDV Asia 1的VP1蛋白抗原性、免疫原性及其蛋白功能研究具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒及血清 含Asia 1 VP1基因的质粒pUC57-Asia VP1由本实验室构建保存(Asia 1 VP1基因由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；原核表达载体 pET-30a(+)、大肠杆菌 DH5α、BL21(DE3)、牛FMDV阳性血清和阴性血清、BHK细胞、FMDV Asia 1 JS/China/2005为本实验室保存；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG、兔抗牛IgG均为Sigma公司产品。

1.2 主要试剂 ExTaq酶、DNA Marker DL2000、IPTG为宝生物工程(大连)有限公司产品；T4 DNA连接酶、BamHⅠ、HindⅢ为Promega产品；DNA胶回收试剂盒为上海华舜公司产品；蛋白纯化试剂Ni-NTA Purification System为Invitrogen公司产品。

1.3 实验动物 2 kg～3 kg新西兰白兔由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.4 VP1基因的扩增及回收 PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，上游引物vp1F：5'-ATTAGGATCCTCAGCGGACCCAGTGACA ACCAC-3'；下游引物vp1R： 5'-CGCCAAGCTTATT ACAGTACCTGTTTCTCAGGTG-3'，在上下游引物中分别引入BamHⅠ、HindⅢ位点。PCR扩增条件为：95℃3 min；94℃45 s、60℃45 s、72℃1 min，30个循环后72℃延伸10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收。

1.5 VP1基因的克隆与鉴定 将回收的PCR产物与pET-30a(+)载体分别用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切后回收，T4 DNA连接、转化感受态细胞DH5α。提取重组质粒(pET-VP1)，用双酶切鉴定。阳性的克隆进行测序做进一步鉴定。

1.6 重组VP1蛋白(rVP1)的表达 将pET-VP1转化感受态细胞BL21(DE3)，进行增菌培养，以终浓度为1.0 mmol/L的IPTG进行诱导，同时设立未诱导对照，诱导6 h后，收集菌体。以SDS-PAGE检测。同时用超声波破碎菌体，离心后分别收集上清及沉淀表达的rVP1可溶性检测。

1.7 表达产物的纯化 将诱导表达菌裂解处理后按文献[7]的方法，对包涵体形式表达的重组蛋白进行纯化。以分光光度计测定蛋白含量。

1.8 表达产物的鉴定

1.8.1 表达产物的western blot分析 将纯化后的rVP1蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜，以1%明胶37℃封闭1 h，分别以FMD阳、阴性牛血清(1∶100稀释)为一抗，37℃孵育1 h，以HRP标记的兔抗牛IgG(1∶5 000稀释)为二抗，37℃孵育1 h，用4-氯-1萘酚显色。

1.8.2 表达产物间接ELISA检测 纯化的rVP1以1 μg/孔包被酶标板，4℃过夜，用1%明胶37℃封闭1 h，分别以8份FMD阴性及阳性血清作为一抗(与大肠杆菌作用后1∶100稀释），37℃作用 1 h，PBST洗涤后加入HRP标记的兔抗牛IgG(1∶5 000稀释)，37℃作用1 h，PBST洗涤后，加入四甲基联苯胺(TMB)37℃避光显色 5 min，加 50 μL 2 mol/L硫酸终止，用酶标仪测定OD630nm值。

1.9 兔抗VP1蛋白多克隆抗体的制备 取纯化的rVP1蛋白4 mg，与等体积的弗氏完全佐剂(Sigma)进行乳化后于新西兰白兔双后足掌皮下注射进行第一次免疫；每只足掌2 mg/0.5 mL，2周后于双侧后肢腘淋巴结内各注射2 mg/0.5 mL上述抗原进行第二次免疫；2周后于背部皮下多点注射4 mg/1 mL经弗氏不完全佐剂进行乳化后的抗原进行第3次免疫；2周后于耳静脉注射4 mg/mL的不加佐剂的抗原0.5 mL进行加强免疫。1周后耳静脉采血测定效价，效价达到要求后心脏采血分离血清。

1.10 兔抗VP1蛋白抗体效价的测定

1.1 0.1 间接ELISA效价的测定 以纯化的rVP1蛋白包被酶标板1 μg/孔，阴性兔血清和抗VP1兔血清进行1∶20～1∶81 920倍比稀释，以HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗(1∶5 000)，按1.8.2的程序进行间接ELISA试验，以免疫血清与阴性血清OD630nm值的比值大于2.5判定为阳性。

1.1 0.2 中和抗体效价的测定 采用BHK细胞，以兔抗VP1血清对Asia 1 FMDV进行中和试验，每个血清稀释度重复4孔，以能中和2孔的血清稀释度为中和效价。

2 结 果

2.1 VP1基因的扩增及表达质粒的构建和鉴定PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳显示约600 bp的扩增条带，与预期639 bp相符。重组表达质粒经限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ消化后可见约600 bp及5 200 bp目的片段和载体片段。

2.2 VP1基因的表达与纯化 重组菌用IPTG诱导后，经SDS-PAGE电泳证明VP1基因获得了表达，表达产物大小约为31.6 ku(图1)。将重组菌超声波破碎后的上清和沉淀分别做SDS-PAGE电泳，结果显示rVP1蛋白以包涵体的形式表达。包涵体经洗涤后用含8 M尿素的PBS缓冲液溶解后获得初步纯化的rVP1，再经Ni-NTA Purification system纯化后，稀释并透析复性后得到纯化的rVP1蛋白。

2.3 表达产物的western blot分析 将纯化后的rVP1进行SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维素膜上，分别以牛FMD阳、阴性血清为一抗，兔抗牛IgG为二抗，结果显示rVP1蛋白与FMD阳性血清反应，可在31.6 ku处出现特异性免疫印迹条带，与FMD阴性血清不反应(图2)。

2.4 重组VP1的间接ELISA检测 以纯化的rVP1作为包被抗原，对经进口ELISA试剂盒(惠赠)鉴定的FMD Asia 1抗体阴、阳性牛血清各8份进行间接ELISA检测。结果显示8份阳性血清的OD630nm值均在1.0以上，8份阴性血清的OD630nm值都在0.2以下，每个样品的OD630nm值为两个检测孔的平均值，与进口ELISA试剂盒检测结果相符(表1)。

2.5 兔抗VP1蛋白多克隆抗体效价的测定 纯化的蛋白经过4次免疫新西兰白兔后，心脏采血分离血清。对高免血清进行间接ELISA检测和病毒中和试验测定其效价。结果表明ELISA效价可达10×211，即 1∶20 480(图 3)；病毒中和试验效价可达 1∶64。

表1 rVP1的间接ELISA与进口检测试剂盒的比较Table 1 Comparison of the indirect rVP1 based ELISA with commercial FMD ELISA kit

3 讨 论

VP1基因在FMDV的研究中具有重要的地位。Suryanarayana等将FMDV VP1的C端部分在大肠杆菌中进行表达，证明表达蛋白经纯化后用免疫沉淀反应法检测到特异性抗体产生[8]。近年来国内许多研究者对Asia 1 FMDV开展了研究，尤其对VP1基因的研究比较多，包括基因测序和分析，单克隆抗体的制备，表位鉴定，在原核、真核和毕赤酵母中进行表达等[9-10]。张中旺等制备了FMDV Asia 1/HeB P1衣壳蛋白前体的抗血清，仅用表达蛋白测定了抗血清效价，但未进行中和活性的检测[11]，在家兔中制备VP1多克隆抗体还未见报道。

本研究利用原核表达了FMDV Asia 1 IND 4/2004株的VP1全基因。表达产物分子量约为31.6 ku，以包涵体的形式存在。我们曾试图通过调整诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度以求获得可溶性表达，但结果仍然是以包涵体的形式表达。这可能与蛋白质本身的氨基酸组成有关，仅仅改变表达菌的培养条件并不能从根本上改变表达形式。Western blot和间接ELISA分析结果显示rVP1能够与FMD阳性血清发生特异性反应，具有良好的抗原性。本研究以纯化的包涵体蛋白VP1免疫新西兰白兔制备了多克隆抗体，该抗体ELISA效价达到1∶20 480，病毒中和试验抗体效价为1∶64，这是国内首次制备特异性的兔抗Asia 1 FMDV VP1基因的多抗，而且能中和我国目前使用的疫苗毒株FMDV Asia 1 JS/China/2005，显示出良好的中和活性。

因此，本研究获得的rVP1可用于开发检测Asia 1 FMDV抗体的诊断试剂，所制备的多克隆抗体为进一步研究VP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定奠定了基础。

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