氧化石墨烯对亚甲蓝的载药性能研究

张 斌，唐建华，谢洪平

（苏州大学 医学部药学院，江苏 苏州 215123）

石墨烯(Graphene)是碳原子紧密堆积成单层二维蜂窝状（honeycomb）晶格结构的一种炭质新材料［1,2］，碳原子排列与石墨的单原子层一样.这种石墨晶体薄膜的厚度只有0.335nm，厚度仅为头发的20万分之一，是构建其他维数炭质材料（如零维富勒烯、一维碳纳米管、三维石墨）的基本单元，具有极好的结晶性及电学质量和非凡的电子学、热力学和力学性能.石墨烯自2004年由英国曼彻斯特大学的Geim等［3］利用胶带剥离高定向热裂解石墨的方法获得后，引起了科学家的广泛关注和极大的兴趣，被预测很有可能在很多领域引起革命性变化.氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）是石墨烯的氧化物，因表面具有羟基、羧基等亲水性基团而具有良好的水溶性，同时也便于功能化和应用.已有报道，GO作为抗癌药物喜树碱的类似物SN38的载体［4］以及GO结合功能分子卟啉用于Ca2+的快速分析［5］等应用.然而，GO定量结合药物或各种功能分子的报道还很少.亚甲蓝(Methyleneblue，MB)是一种吩噻嗪类染料，化学名为氯化3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓三水合物，结构式为C16H18ClN3S·3H20.临床上用作氰化物和亚硝酸盐中毒的解毒剂，也是光化学法灭活新鲜单袋血浆中病毒的光敏剂.在有关吸附剂的吸附特性的表征中，染料也常作为模型吸附质，如吸附剂的吸蓝量就是指其对亚甲蓝的饱和吸附量.因此亚甲蓝为吸附研究中最为常用的模型染料之一［6,7］.

本文采用改进的Hummer法［4］制取氧化石墨烯，然后在蒸馏水中利用超声分散将氧化石墨剥片得到GO.以MB为模型分子，采用紫外分光光度法考察GO对MB的载药结合量，为GO结合具有紫外吸收的药物分子或各种功能分子提供定量方法.

1 实验

1.1 仪器与试剂

UV-2401紫外-可见全波长扫描仪（日本岛津公司），透射电子显微镜（BHV-55，日本理研电子公司），TGL-16B高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），KA-1000台式离心机（上海安亭科学仪器厂），KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HH-4数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），EL104电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）.

石墨（固定碳含量99.9%，325目，青岛恒锐密封制品厂），KMnO4（国药集团化学试剂有限公司），H2SO4（95.0-98.0%，昆上金城试剂有限公司），H2O2（30.0%，上海联试化工试剂有限公司），BaCl2(上海化专实验二厂)，HCl(36.0-38.0%，昆上金城试剂有限公司)，亚甲蓝（生物染色剂，上海山浦化工有限公司），PBS缓冲溶液（0.02mol/L，pH7.33），其他试剂均为分析纯，实验用水为三次蒸馏水.

1.2 氧化石墨烯的制备

将1g石墨加入到装有23ml浓H2SO4的圆底烧瓶中，机械搅拌12小时.低温条件下缓慢加入6g KMnO4后，将温度升到40℃反应30分钟，再将温度升到90℃反应1.5小时.缓慢连续加入46ml三蒸水，使温度上升到98℃，在此温度下维持25分钟.然后加入140ml三蒸水和10ml 30%的H2O2，在H2O2作用下，悬浮液变成亮黄色.为了纯化氧化石墨，先用5%的HCl反复洗涤，直至无硫酸根离子（用BaCl2溶液检测），再用三蒸水充分洗涤至近中性.将纯化后的氧化石墨超声2小时，然后离心3000rpm 30分钟，上层即为GO.

1.3 氧化石墨烯结合亚甲蓝

1.3.1 溶液配制

精密称取MB 0.1160g(约310.2μmol)，置于1000ml的容量瓶中，用PBS缓冲溶液溶解并稀释至刻度，配成310.2μmol/L的储备液，避光、密封保存.

1.3.2 亚甲蓝的标准曲线

用MB储备液和PBS缓冲溶液分别配制含MB 1.85μg/ml、2.31μg/ml、2.75μg/ml、3.24μg/ml、3.70μg/ml的标准溶液，于665nm处测定其吸光度，以吸光度值A对浓度C作图.

1.3.3 游离亚甲蓝的含量测定

将MB储备液按不同倍数稀释，得到一系列不同浓度的MB溶液.将制备的GO（1mg/ml）用PBS缓冲溶液稀释成含GO 10μg/ml的溶液.将3ml不同浓度的MB溶液（1.93～58μg/ml）与3ml GO溶液（10μg/ml）分别加入8支具塞试管中，室温振荡2h，充分混匀.取出后高速离心12000rpm 15 min，以665nm作为检测波长，测定各上清液的吸光度，平行测定3次，取平均值，由MB的标准曲线计算平衡吸附液中游离的MB含量.

2 结果与讨论

2.1 氧化石墨烯的表征

石墨烯的理论研究已有60多年的历史，被广泛用来描述不同结构炭质材料的性能.20世纪80年代，科学家们开始认识到石墨烯可以作为(2+1)维量子电动力学的理想模型.但一直以来人们普遍认为这种严格的二维晶体结构由于热力学的不稳定性而难以独立地稳定存在.直到2004年，Geim等［3］用一种极为简单的方法剥离并观测到了单层石墨烯晶体，才引起了科学界新一轮的“碳”热潮.同样，GO也是单层二维晶体.对合成的GO用透射电镜进行表征，其结果见图1.从图1可以看出，GO表面并不平坦，而是有很多起伏和褶皱区域，正是这些区域才使得二维晶体能够稳定存在［8］.

图1 氧化石墨烯的透射电镜图

2.2 亚甲蓝检测波长的选择

由GO与MB的紫外吸收光谱（图2）可看出，GO在230nm处有最大吸收峰，在300nm处有一个肩峰，这两个特征吸收峰分别对应芳香环C-C的π-π*跃迁和C=O的n-π*跃迁［9］.而MB在可见光区665nm处有强吸收峰，选择此波长测定其含量具有较高的灵敏度，且GO在此波长处基本无吸收，不会对MB的测定造成干扰，因此选择665nm作为GO吸附MB后对MB的检测波长.

图2 亚甲蓝与氧化石墨烯的紫外吸收光谱1.MB（1.85μg/ml）；2.GO（11.76μg/ml）

图3 亚甲蓝浓度与吸光度的关系

2.3 亚甲蓝检测的线性范围

以665nm处的吸光度值A对亚甲蓝浓度C作线性回归，回归方程为A=0.2065C-0.05148，相关系数r=0.9999.结果显示，亚甲蓝浓度在1.85～3.70μg/ml范围内呈现良好的线性关系（见图3）.

2.4 氧化石墨烯对亚甲蓝的载药性能

氧化石墨烯对亚甲蓝的载药性能用GO对MB的平衡吸附量进行表征，即

其中，MGO为药物载体GO的质量（g），M0为加入研究体系的MB的量（mg），Mfree为平衡吸收后游离的MB的量(mg)，Qe即为GO对MB的平衡吸附量（即载药量，mg/g）.其载药量曲线参见图4.

图4 氧化石墨烯对亚甲蓝的载药量

从图4可知：当亚甲蓝的初始浓度C0从0.967μg/ml升高至2.416μg/ml时，载药量Qe从68.3mg/g升高至169.9mg/g，提高了近2.5倍.说明在亚甲蓝浓度较低时，随浓度C0的升高，氧化石墨烯对MB的载药量有显著的提高，这是由于氧化石墨烯具有大量的自由表位可供亚甲蓝结合.

而随着亚甲蓝浓度C0的进一步增加，氧化石墨烯表面的自由表位逐渐被亚甲蓝占据，而总的表位是有限的，所以载药量随亚甲蓝浓度升高而增加的程度逐渐变缓，即图4中C0在2.416-9.667μg/ml范围内所表征的载药情况.当亚甲蓝浓度从9.667到19.334μg/ml时，载药量Qe从204.734增加到218.051mg/g，增加量极微，表现出了吸附平台区.因此，本文认为C0=9.667μg/ml时的吸附量204.734mg/g即为饱和吸附量.

当亚甲蓝浓度C0从19.334μg/ml继续升高时，吸附量显著增加，但此时体系中能够观察到细微的絮状沉淀.其原因可能是氧化石墨烯表面电离羧基所带的负电荷几乎完全被MB所中和，使溶液中GO保持稳定分散的条件被破坏，由GO极大的表面积所导致的团聚作用使其产生絮状沉淀.团聚颗粒通过非特异性的吸附作用，将溶液中游离的亚甲蓝一并沉降下来，使上清液中所测得的亚甲蓝含量偏低，造成载药量出现继续上升的结果.该类沉降现象不利于药物生物利用度的提高，因此，GO对MB的最大载药量认为是C0=9.667μg/ml时的载药量204.734mg/g，较通常的药物载体表现出了一定的载药优势［10］.

氧化石墨烯对亚甲蓝所表现出的较理想的负载量，主要归因于它具有较大的比表面积，通过氢键、π键等作用［11］，使染料、药物等分子结合到氧化石墨烯表面.同时，静电吸附对此结合过程也有影响，在pH7.33的PBS缓冲环境下，氧化石墨烯表面丰富的羧基将电离而带负电荷，而亚甲蓝电离成正离子，静电吸附进一步提高了氧化石墨烯对亚甲蓝的结合量.

3 结论

本实验以GO为载体，MB为模型分子，采用紫外分光光度法考察GO结合MB的含量，静态吸附试验表明GO对MB的最大结合量为204.734mg/g.该研究为GO结合具有紫外吸收的药物分子或各种功能分子提供了定量方法.

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