许璞教授的紫菜属海藻遗传学研究工作评述

沈颂东

（苏州大学 基础医学院与生命科学学院，江苏 苏州 215123）

藻类遗传学研究始于上世纪50年代.60年代前后挪威藻类学家Føyn和Fjeld以绿藻石莼（Ulva）为材料，通过诱变获得许多形态突变体，他们的目的是通过观测突变性状表达来研究发育生物学问题，但是研究进行了10多年后停止了，以后再没有看到相关的报道.70年代中期开始，加拿大遗传学家John van der Meer及其研究团队，采用江蓠（Gracilaria）等红藻材料开展遗传学问题研究，从诱导色素突变体开始，开展了一系列极富挑战的研究工作，进而验证了遗传学基本规律在海藻中的表现以及特殊的遗传机制.我国是海藻栽培利用发展较早的国家，上世纪50年代末海带栽培业已经形成规模，60年代初著名遗传学家方宗熙先生开始了对海带（Lami⁃naria japonica）遗传学的研究，其在数量性状方面的研究进展令人瞩目，70年代又建立了雌、雄配子体克隆技术，为褐藻遗传学和育种学研究的发展打下了坚实基础.经过遗传学家和藻类学家的共同努力，海藻遗传学研究在近半个世纪中已有长足进步.2005年，在国家科学技术著作出版基金资助下，我国海藻遗传学研究者编著完成《海藻遗传学》，著名海洋生物学家曾呈奎先生在序言中有这样的表述：国外第一部藻类遗传学专著是Lewin先生1976年主编的《The Genetics of Algae》，此后再没有这方面的专著问世.张学成、秦松、马家海和许璞等编著的《海藻遗传学》，是我国出版的第一部海藻遗传学方面的专著.这本专著全面总结和展现了当前国内外海藻遗传学研究的成果，阐明了海藻遗传学的基本原理以及藻类遗传的特征和机理，并突出介绍了我国海藻遗传学研究的实践、水平和成就［1］.许璞教授是国内较系统开展海藻遗传学的专家，负责撰写该书紫菜（Porhyra）遗传学内容，其中大部分为其90年代中期攻读博士学位时的研究结果.通过国内外文献比较，可以看到许璞教授及其研究团队在紫菜属海藻的突变规律、遗传分析和染色体研究等方面开展了大量工作，研究进展及其成果具有科学意义.

1 紫菜色素突变体及其突变规律

紫菜色素突变体在上世纪70年代初被注意到，最初发现的色素突变体是在栽培群体中发生的，Miura（1974）观察认为栽培群体中的红色藻体具有遗传性，是自发产生的色素变异体［2］.Kobara等（1976）采集到具有绿色特征的藻体，通过培养比较获得绿色突变体［3］.Miura等（1977）对东京湾的栽培群体调查观察到，很多色素突变体是以嵌合体的形式出现的，嵌合体的出现频率主要依据栽培方式的变化，因此推测色素突变体的出现以及嵌合体的发生频率与种源的遗传组成和种苗繁育方式有关［4］.Migita等（1983）和张佑基等（1987）也报道在野外发现紫菜的色素突变体［5,6］.紫菜的色素突变体形形色色，除了红色型和绿色型突变体外，Miura等（1978）在条斑紫菜中获得由红色型与绿色型杂交产生的黄色型［7］.Migita等（1983）采用同样方法也获得了黄色型，并从红色型与黄色型杂交中还获得橙色型.随后还报道了一些新的突变型［8-10］.Katayama（1983、1984）试图获取紫菜人工诱变的突变体，试验多种化学诱变剂处理，但未获得存活的突变体［11,12］.戴继勋等（1990）、严兴洪等（1990、1992）采用秋水仙碱或紫外线诱变紫菜培养细胞，观察到一些红色变异体［13-15］.至上世纪90年代中期，只有Mitman等（1994）在进行P.purpurea的遗传研究中，使用诱变剂亚硝基胍处理获得5个稳定的突变体，其中3个属细胞核突变，2个为细胞质突变［16］.

许璞教授关于紫菜属海藻突变规律的研究工作主要由文献［17-21］表述，概述如下：

（1）紫菜属海藻诱变方法及其特点.一般诱变剂对于紫菜致变特别是色素突变的效果不明确，与红藻江蓠的突变不同，紫菜的诱变剂选择范围较窄，仅甲基亚硝基胍（NNG）可诱导出人工的色素突变体.经系统研究不同紫菜物种对NNG的致变反应，证实诱变剂对于不同紫菜物种的影响相似，但在不同生长阶段，各生长藻体致变结果差异明显，壳孢子最易发生突变，叶状体次之，丝状体较为保守，但隐性突变仍与低剂量效应相关.对于紫菜属海藻致变特点的研究表明，紫菜壳孢子对诱变剂反应敏感，便于进行诱变剂的效应分析.但是壳孢子是二倍体，其突变效应要到减数分裂后才能表现出来.叶状体诱变后往往得到含有突变细胞块的嵌合体，可以对诱变结果作出定量分析.对丝状体的诱变涉及到二倍体细胞的突变规律.就色素突变性状而言，藻丝细胞显示的突变为显性突变或细胞质突变.然而，突变型多为隐性突变性状，发生突变的二倍体丝状体细胞仍表现为野生型，突变的结果要到丝状体细胞成熟后产生配子，即壳孢子萌发分裂时才能被观察到.丝状体材料适宜保存，诱变操作简单可靠，能够获得大量有活力的后代突变体，并且重要的是经诱变处理的丝状体，其切段可接种培养至贝壳上，只要切段大小和培养密度合适，藻落生长类似于培养基上的生长菌落，便于进行突变观察和遗传分析.

许璞教授还与其他合作者开展60CO-γ射线的诱变研究［22,23］，研究结果为当前的紫菜诱变育种提供了主要技术方法.

（2）紫菜属海藻色素突变的表达规律.紫菜叶状体在诱变作用下，以单个细胞为单位发生点状突变，生长形成的每一颜色斑块都是一次突变的产物，起源于最初的一个突变细胞，一个细胞的突变只生长成一种突变组织，多个突变细胞可以生长成多种突变组织，诱变导致各种突变组织无规则镶嵌生长，叶状体经诱变引发的突变显示典型的单倍体细胞致变结果.而经诱变后培养生长的丝状体，其后代显示突变性状在世代转化过程中的表达特征：一是丝状体藻落直接发生颜色变化，其突变丝状体产生的叶状体后代仍为相应的突变型，突变表达与壳孢子萌发分裂无关，该突变与细胞质遗传的基本特征相符；二是那些在外观上没有发生突变的丝状体仍可以产生大量突变体，这种突变多数不在丝状体阶段表达，但在壳孢子萌发分裂时突变性状随细胞分裂发生分离，表明诱变引发的隐性突变随着世代转变由单核表达显示，表现隐性的核基因突变特征.与丝状体后代的突变表达特征相似，诱变后的壳孢子在萌发分裂时发生突变颜色的分离，同样符合二倍体细胞转变为单倍体细胞的突变表达规律.研究证实，紫菜属海藻的突变规律及其表达特点，不仅与生长藻体的倍性有关，而且与世代转变过程中的个体细胞倍性发生变化有关.

（3）紫菜属海藻突变规律显示的减数分裂过程与早期发生模式.在条斑紫菜（P.yezoensis）、坛紫菜（P.hai⁃tanensis）、少精紫菜（P.oligospermatangia）和华北半叶紫菜（P.katadai var.hemiphylla）4种实验材料中，发生隐性突变的丝状体后代中多为2～4色块嵌合的个体，未发现4色块以上的嵌合个体存在.壳孢子经诱变后，其萌发分裂的个体无例外地重复了嵌合体的发生，分裂生长个体也为2～4色块的嵌合体.实验研究证实，嵌合体的产生只与壳孢子萌发的最初两次细胞分裂有关，不同遗传背景的藻体生长组织来源于壳孢子萌发分裂产生的4个初始细胞，表明与减数分裂的机制相联系.在所观察的紫菜物种中，突变色素标记的嵌合体显示条斑紫菜、坛紫菜和少精紫菜属线性四分子构造，表现为直线生长的发育特性.华北半叶紫菜几乎未观测到2色块以上的嵌合体，这与其壳孢子附着分裂后基部细胞不再分裂有关，显示为典型的四分子缺失型，其顶端细胞再次分裂的横向性，使生长个体表现两侧发育的特性，属顺序四分子的特殊生长体.突变性状在壳孢子萌发分裂过程中的表达规律，为研究紫菜属海藻减数分裂和早期发育生长模式提供了重要依据.

2 紫菜属海藻遗传特征及其分析

条斑紫菜5种自发产生的突变型分别与野生型杂交，产生的丝状体表现野生型，后代叶状体（F1）表达了各自双亲的颜色，两种色型按1：1分离，表明这5种突变型各自受一个突变的隐性核基因控制.当几个突变型之间杂交，也产生野生型丝状体，各自后代的叶状体中，除了双亲颜色还出现两个重组型，其中一个是新的突变颜色，而另外一个却总是野生型.重组突变型的杂交测试显示属双隐性突变体（Miura et al.1980；Miura et al.1985；Ohme et al.1986；Niwa et al.1993）［8,10,24,25］.Ohme 等（1988）［26］、Niwa等（1993）和Hamada等（1994）［27］对上述5种突变型的杂交结果进行四分子分析，测算得到各自突变位点与着丝粒的遗传距离，并分析了各突变位点之间的联系.对杂交子代类型的分析表明，杂交涉及到一个突变基因，子代中除出现双亲个体外，还有6种嵌合个体，它们与减数分裂后形成的四分子类型相符，其中2个属于非交换型，另外4个为染色体交换形成.杂交涉及两个突变基因，子代中除双亲个体还增加两个重组个体，各种嵌合体可以归纳为36个类型，与预期的四分子类型完全相符（Miura et al.1994）［28］.P.purpurea属雌雄同株、左右异性的紫菜物种，对它的遗传研究是以诱变产生的两个色素突变体进行的，杂交结果表明分别为核、质突变，其中细胞核突变位点距着丝粒约37.0 m.u.，具较高的染色体交换率，进一步遗传分析显示P.purpurea的雌雄性状由性别基因决定，受一对等位基因控制表达（Mitman et al.1994）［16］.

许璞教授进行的遗传分析工作在文献［17,18］中的表述概括为：在8个诱变产生的条斑紫菜色素突变体中，3个属单隐性核基因突变，3个受核外突变基因控制，1个红色与亮红色嵌合型由核、质突变基因表达，另1个隐性突变的丝状体后代分离出两个表型相同、突变位置邻近的pnk1和pnk2核基因.其中两例遗传分析涉及深入，对于认识紫菜植物的特殊遗传规律十分主要，主要结果概述如下：

（1）两个相似突变基因pnk1和pnk2分析.1个疑似突变的丝状体Yt-6产生的后代中，被检1074幼藻，记录：pink 1063，pink/wt/yellow 6，wt/yellow 3，wt 2.通过随机孢子分析，计算得到重组频率=0.74 m.u.，分析表明，突变体Yt-6遗传表现受两个表型相似、突变位置邻近的隐性核基因pnk1和pnk2控制.在丝状体阶段，pnk1和pnk2处于杂合状态，藻丝呈野生型.进入叶状体阶段，当壳孢子开始萌发分裂，处于杂合状态的两个突变基因随着染色体分配到4个子细胞，它们各自决定的颜色立即被表达，形成双亲的颜色，即粉红色.pink个体属亲代双型（PD），它们有两种颜色表型，但由于pnk1和pnk2两基因表达的颜色太过于接近，或者说是相同的，以致无法被觉察.Pink/wt/Yellow、wt/Yellow和wt个体，前者为四型（T），后二者为非亲代双型（NPD），它们是重组的结果.非亲代双型wt个体，属基部细胞不分裂而造成的四分子缺失现象，同样理由Yellow个体也可能出现，实验中未被观察到可能与事件发生的频率低有关.

（2）核质双突变分析.一突变丝状体藻落Yr-11，产生的叶状体后代中出现很少量的颜色嵌合体（＜1%），其嵌合叶片组织都呈红色，其中一种色泽较深，和后代中多数的单一突变色型个体相似，另一种为亮红色，是新出现的突变颜色.分别切取这些个体的不同颜色叶片进行杂交实验，得到不同的结果：单一突变色型与野生型杂交，正反交结果的后代都表现母本性状，进一步与嵌合个体中的两种突变色型杂交，结果也显示母本遗传的特征，表明单一突变色型个体表现为细胞质突变，它的颜色表达受核外基因Mred控制.嵌合体中颜色较深的红色型与野生型杂交，正反交的后代也都表现母本性状，与其它两种色型杂交的结果也证实它同样属于核外遗传类型.另一种嵌合色型亮红型与野生型杂交，亮红型为母本时杂交产生的叶状体全都是红色型，与其它两种色型杂交，也只产生红色型后代叶状体，表明它仍属细胞质突变，但是与野生型为母本的杂交，其结果与前两者完全不同，野生型♀×亮红型♂，产生的丝状体为野生型，在它们的F1叶状体中，除出现野生型个体外，还出现大量野生型与红色型嵌合的个体，并还有少量的红色型个体，表明突变体亮红型还受另一个基因控制，即隐性核基因Nred.上述实验揭示，Yr-11实际上产生两个突变型，将它们分别标记为Yr-11a与Yr-11b，Yr-11a表现红色型突变，后代中占绝大多数的单一突变个体属这一突变型，嵌合体中颜色较深的红色型同属这一类型，这个突变型的表达基因是Mred，为细胞质突变类型，Yr-11b是嵌合体中的另一种突变型，亮红型这个颜色表型是基因Mred和Nred共同作用的结果，为核质双突变.

3 紫菜属海藻二倍体细胞核分裂特征研究

自Drew（1949）［29］发现壳斑藻（Conchocelis rosea）是由叶状体成熟产生的果孢子（carpospore）萌发后钻入贝壳形成，证明了紫菜丝状体（conchocelis）阶段的存在以来，科学家们对紫菜丝状体进行了一系列的研究.其中关于细胞倍数性的研究，大多数学者观察到双倍体的存在（Fujiyama，1957；Yabu et al.，1963，1969，1970，1971，1972；Migita，1967；Kito，1967，1968，1974，1978；Giraud et al.，1968；Chen et al.，1970；Mumford et al.，1977；Hawkes，1977，1978；Krishnamurthy，1984；Ma et al.，1984；戴继勋，1985，1987；Burzycki et al.，1987；Kapraun et al.，1987；Tseng et al.，1989；）［30-52］.但也有一些学者观察到紫菜丝状体有单倍体的现象.Krishnamurthy（1959）报道P.purpurea的生活史各阶段均为5条染色体，Conway等（1973）对P.papenfussii丝状体的观察得出单倍体的结论，Freshwater等（1986）报道在P.carolineusis生活史的所有阶段均为4条染色体［53-55］.Mumford等（1977）对北美西海岸15种紫菜丝状体进行了观察，结果认为有3种丝状体是双倍体，4种是单倍体.孙爱淑等（1987）观察了甘紫菜、条斑紫菜和华北半叶紫菜丝状体细胞，结果认为绝大多数为双倍体，在个别丝状体细胞中为单倍染色体数［56］.

另一长期以来有争议的重要问题是关于紫菜减数分裂发生位置.Tseng等（1955）研究了P.tenera的受精果胞的分裂过程，观察到在果胞第一次分裂中出现染色质丝的联会，并在果胞的第二、三次分裂时观察到单倍的染色体数，从而认为减数分裂是在受精果胞的第一次分裂时进行，产生的果孢子是单倍体［57］.不过，Magné（1952）［58］、Yabu等（1963）、Yabu（1969，1971，1972）、Kito（1967，1968，1974）、Mumford等（1977）和Hawkes（1977，1978）观察到果孢子不是通过减数分裂产生的，它含有双倍染色体数，但他们都没有描述减数分裂的发生.其后，Migita（1967）、Giraud等（1968）、Kito（1974，1978）和Wang等（2006）［59］报道壳孢子形成时发生了减数分裂.他们都是以观察到双线期和终变期的染色体联会作为判断依据.但是，Burzycki等（1987）和Tseng等（1989）认为，可能Migita（1967）、Giraud等（1968）和Kito（1974，1978）将观察到的孢子囊枝细胞染色体配对（somatic pairing）误认为减数分裂的同源配对.Ma等（1984）、Burzycki等（1987）和Tseng等（1989）通过细胞学观察结果，提出减数分裂发生在壳孢子萌发时期.

紫菜染色体数较少［60,61］，然而研究过程中出现如此众多的重要争议，人们不禁怀疑这是否与其核分裂中的重要特征未被认识有关.许璞教授主持的研究团队依据长期积累的观察资料，发表了紫菜丝状体细胞核分裂的观察研究结果（文献［62］），对重要争议问题仔细探讨，认为：

Migita（1967）和Kito（1978）对条斑紫菜果孢子萌发核分裂进行了详细描述，认为其核分裂过程与一般高等植物的有丝分裂过程相同.孙爱淑等（1987）支持了他们的观点.在我们的观察中，果孢子萌发核分裂为有丝分裂，在前期和中期出现同源染色体配对的特征.

在条斑紫菜营养藻丝细胞分裂中，Migita（1967）和Kito（1978）都报道此阶段不能清楚地观察到核分裂的具体情况，只在营养藻丝细胞分裂中期观察到6条染色体.孙爱淑等（1987）描述了分裂的详细过程，认为其核分裂基本为有丝分裂，在晚前期和早中期能清楚地看到两个同源染色体靠得很近，有的在一点或几点上交叉，有的完全配对.我们的观察结果与孙爱淑（1987）一致.Krishnamurthy（1959）观察到P.purpurea的丝状体细胞分裂晚前期为5条染色体，Freshwater等（1986）观察到P.carolineusis丝状体细胞4条染色体也出现在分裂前期，他们据此得出单倍体数的结论.然而，后来Kito（1978）通过细胞学观察认为P.purpurea的丝状体细胞含有10条的双倍染色体数，Mitman等（1994）的细胞学观察和遗传学实验结果也证明P.purpurea的丝状体为二倍体世代.我们认为根据较多的观察结果，Krishnamurthy等作者可能未注意到同源配对对观察结果的影响，由于紫菜二倍体细胞核分裂的同源配对特点，在观察中很难对中期以前的核分裂染色体数进行分辨计数.

在孢子囊枝阶段，Migita（1967）将其分为未成熟和成熟两种类型，在未成熟的孢子囊枝细胞分裂中，各期特征与一般的有丝分裂过程相同.在成熟的孢子囊枝细胞核分裂开始时，6条染色体成对出现，每对染色体两两之间关系密切，并将这一过程认定为双线期，到终变期可观察到3条二价染色体，以后它们分成两组向细胞两极移动.而我们的观察结果表明，当这里所指的成熟孢子囊枝细胞为壳孢子囊分裂细胞时，那么Migita所看到的染色体配对现象与我们的观察是一致的，但据大量制片的观察，紫菜二倍体细胞核分裂的细线期特征及变化过程并不容易分辨，他所认为的双线期与我们观察的壳孢子囊细胞分裂的中期特征吻合，而所描述的终变期特征与配对染色体收缩的观察镜像相似，因此其减数分裂的认识可能受到分期判断不准确的影响.Kito（1978）也将孢子囊枝分为成熟与未成熟两种类型，他所指的未成熟类型属初期孢子囊枝细胞，但所述成熟类型的细胞学特征有误，与发育后期的孢子囊枝细胞以及壳孢子囊分裂细胞相混淆.Kito描述，在成熟的孢子囊枝细胞分裂中期，染色体排列在赤道面上，紧密配对难以识别，形成3个二价体，这与本文关于前期末配对染色体聚合的观察镜像相似.Kito将此阶段认为是减数分裂的终变期，同样Wang等（2006）观察到孢子囊枝阶段的终变期也作了类似解释，我们认为这只是同源染色体两两紧密配对的结果，其中重要判断依据是核分裂后期染色单体仍然进行了分离.

在壳孢子萌发核分裂中，Ma等（1984）观察到P.yezoensis壳孢子萌发核分裂前期末同源染色体配对，分裂中期出现3条环状的染色体，分裂后期6条染色体对等分离.Burzycki等（1987）观察到P.torta壳孢子萌发核分裂末期，每条染色体含两个染色单体.Tseng等（1989）观察结论也认为减数分裂发生在壳孢子萌发分裂时期.我们对减数分裂的观察研究结果肯定了这一观点.

Cole等（1983）观察发现大多数红毛菜属植物的双倍核阶段，在分裂前期两组染色体同源配对，即体细胞染色体配对（somatic pairing）［63］.Burzycki等（1987）在P.torta的孢子囊枝细胞，Tseng等（1989）在P.tenera、P.yezoensis和P.katadai var.hemiphylla的营养藻丝细胞，也观察到有丝分裂同源染色体配对现象.更早些，Tseng等（1955）在观察甘紫菜受精卵核分裂过程时，就对配对的染色质丝联会或交叉现象进行了描述.我们的细胞学观察研究结果证实，不同紫菜物种的二倍体细胞分裂前期、中期均出现同源染色体配对，有丝分裂同源染色体配对行为是紫菜丝状体核分裂的重要特征.从我们的图像分析中可以看到，处于不同发育阶段的丝状体细胞，在核分裂的晚前期或前期末均出现类似于减数分裂染色体配对的现象，有些图像与典型的终变期特征十分相似，这也解释了一些作者对减数分裂判断错误的原因.

紫菜染色体观察困难是公认的，许璞教授及其合作者是国内外为数不多的专业团队之一，其研究意见深入，揭示问题有助于加深对紫菜细胞学的研究认识.

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