Clade 2.2 H5N1亚型禽流感重组灭活疫苗株的构建及其对小鼠免疫效力的评价

裴 磊，王国俊，熊 杰，李雁冰，姜永萍，陈化兰

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001)

2005年，我国青海省发生严重的禽流感疫情，造成大量野鸟死亡[1]。此后，禽流感相继在多个国家发生并对人类具有致病力。禽流感病毒(AIV)易于变异，多种动物可充当其生物载体，这给动物和人类的健康带来威胁，因此需要研制出有效的疫苗对其预防。

以 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(简称 PR8)为内部基因，利用反向遗传操作技术制备的重组疫苗，具有应用广泛、安全性好、抗原成分齐全、诱导有效免疫持续时间长、亚型间交叉免疫保护能力强等特点[2]。A/Bar-headed goose/Qinghai/3/2005(BHGQH/05)H5亚型禽流感野鸟分离株的代表株，属于2型(Clade 2.2)进化支。本研究选择BHGQH/05作为表面基因供体，PR8作为内部基因供体[3-5]，利用反向遗传操作技术制备具有高增殖特性，HA基因多个连续碱性氨基酸缺失的重组弱毒疫苗株，并在BALB/c小鼠体内评价其免疫效力，以期作为人用H5亚型禽流感疫苗的技术储备。

1 材料和方法

1.1 病毒株及内部基因表达质粒 病毒株BHGQH/05和A/Chiken/Vietnam/1180/2006(H5N1)(简称CKVN/06)由本实验室保存；内部基因的转录质粒和聚合酶基因的蛋白表达质粒均来自于PR8病毒株，由美国CDC的Kanta Subbarao博士馈赠。

1.2 鸡胚、细胞与实验动物 10日龄SPF鸡胚由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供；低代次Vero细胞购自中国科学院武汉病毒研究所；4周龄～6周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司，所有小鼠感染实验均在生物安全三级实验室中进行。

1.3 HA和NA基因pBD双向表达载体的构建pBD载体的处理按照文献[6]中的方法。根据BHGQH/05的HA、NA序列，设计2对引物，按照文献[8]中的方法扩增HA和NA基因片段，并缺失HA基因上连续碱性氨基酸基因，序列测定正确后，将PCR产物在1 mM浓度的dCTP和dTTP存在的条件下分别连接到pBD载体中，转化JM109感受态，提取重组质粒，PCR鉴定正确的质粒进行序列测定和分析。

1.4 病毒拯救 重组质粒转化JM109感受态，提取质粒，测定浓度。将这2个重组质粒和其它PR8的10个重组质粒共12个重组质粒按参考文献[7]的方法共转染Vero细胞进行病毒拯救，细胞液接种SPF鸡胚尿囊腔。提取救获病毒的RNA，RT-PCR扩增病毒基因并测序鉴定。将病毒以106EID50/100 L接种于10日龄SPF鸡胚，收集尿囊液分装，-80℃保存，并命名为BHGQH/PR8。

1.5 病毒的纯化和定量 将收集的尿囊液以30000 r/min超速离心，再经过蔗糖密度梯度离心纯化病毒液，用SDS-PAGE确定HA蛋白占总蛋白的百分比，测定总蛋白浓度，将病毒总蛋白稀释至0.1 μg/μL，福尔马林灭活，与等浓度Al(OH)3佐剂等体积混合，使混合液的病毒蛋白浓度为0.05 μg/μL，室温震荡过夜备用。

1.6 BALB/c小鼠的免疫保护试验 将小鼠随机分为5组，20只/组，经腿部肌肉免疫10 μg病毒蛋白。第1组为单剂量不加佐剂组，第2组为单剂量加佐剂组，第3组为加强免疫不加佐剂组，第4组为加强免疫加佐剂组，第5组为对照组(注射200 μL灭菌PBS)。单剂量和加强免疫4周后采血，分离血清，受体破坏酶处理，测定HI抗体和NT抗体滴度。上述5组小鼠在单剂量和加强免疫4周后各取一半，分别用100 MLD50剂量的同源病毒BHGQH/05和异源CKVN/06攻击，攻毒后3 d每组剖杀3只，采集鼻咽部、脑、脾、肾和肺用于病毒分离滴定。连续观察14 d，记录体重变化和死亡情况。

2 结果

2.1 重组pBD双向表达载体的构建 按1.3中方法构建含BHGQH/05的HA、NA基因的2个重组pBD载体。经过测序鉴定，获得与BHGQH/05的HA、NA基因一致且克隆位点和序列完全正确的2个重组质粒。

2.2 重组病毒的救获与鉴定 12个重组质粒共转染Vero细胞进行病毒拯救，扩增救获的病毒基因并测序，序列比较显示救获病毒无任何核苷酸序列的变化，其RNA完全来源于12个质粒系统，表明救获的病毒完全正确。

2.3 病毒HA蛋白的定量结果 根据蛋白定量的标准曲线(图1)计算出总蛋白的浓度，同时 SDSPAGE测定HA蛋白占总蛋白的百分数，结果HA蛋白约为总蛋白含量的30%(图2)。由这两种方法确定HA蛋白的浓度以制定免疫剂量。

2.4 单剂量以及加强免疫后HI和NT抗体的测定结果 单次免疫能诱导产生与同源病毒反应的HI抗体，抗体滴度为66.7；未检测到与异源CKVN/06交叉反应的HI抗体，也未检测到与同源和异源病毒反应的中和抗体。加强免疫诱导产生的HI和NT抗体滴度显著上升，产生与同源和异源病毒反应的高滴度HI和NT抗体(表1)。

表1 H5N1亚型灭活疫苗株单剂量和加强免疫小鼠后诱导产生的HI和NT抗体Table 1 Serum HI and NT antibodies elicated in mice following a single dose and two doses of H5N1 subtype in-activated vaccine

2.5 免疫小鼠用同源和异源病毒攻击的体重变化和死亡结果 用同源和异源病毒攻击的所有单剂量和加强免疫组小鼠体重均呈上升趋势，无发病或死亡情况。而对照组小鼠体重在第3 d开始显著下降，并在11 d内全部死亡(图3，图4)。

2.6 免疫小鼠用同源和异源病毒攻击的脏器滴定结果 单剂量免疫对照组多个脏器分离到病毒，肺脏和鼻咽部检测到高滴度病毒，而免疫组的肺脏和鼻咽部检测的病毒量比对照组低，同时，佐剂的加入能够降低组织中的病毒含量。加强免疫组小鼠产生完全免疫保护，其肺和鼻咽部未检测到病毒，而对照组小鼠检测到高滴度的病毒，脾、肾和脑也检测到病毒(图5，图6)。

3 讨论

本研究开展了Clade 2.2 H5N1亚型AIV BHGQH/05灭活疫苗株的构建及其对小白鼠免疫效力评价的研究工作，选用Vero细胞系作为转染细胞以救获疫苗株，为该疫苗进一步在灵长类动物的免疫评价打好基础，并为将来的临床试用提供可能。

目前已有的成人流感疫苗的免疫程序只有单次免疫。但是本研究结果显示，采取加强免疫更利于对还未产生免疫记忆的H5N1流感病毒的免疫，加强免疫能显著提高抗体水平，对较高剂量的同源和异源病毒的攻击提供完全保护。单次免疫虽然对BALB/c小白鼠提供100%保护，但肺和鼻咽部检测含有病毒，而且只能检测到低水平的NT抗体和HI抗体，这与最近的文献报道一致。较低的抗体水平却能产生有效保护，其具体机制目前还不甚清楚，但下面两个因素对解释这种机制提供了参考。其一，Hoffmann等发现用某H5N1病毒株研制成疫苗，产生低水平的HI抗体，但是HA基因上单个S223N的替换即可显著提高抗体水平[9]；其二，细胞免疫反应也可能发挥重要作用[10]。

此外，本研究还是国内首次采用野鸟中分离的AIV作为HA和NA基因供体制作疫苗，将对预防野鸟引起的禽流感暴发发挥重要作用。研制的灭活疫苗能够对1型进化支的异源病毒攻击提供良好的免疫保护，显示其具有良好的应用前景，是我国防控高致病性禽流感的有效的储备疫苗毒株。

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