不同发育时期旋毛虫脂肪酸组成的研究

赵风强，路义鑫，韩彩霞，张晓波，兰 静，宋铭忻*

(1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030；2.黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨150086)

旋毛虫(Trichinella spiralis)是一种危害严重的人兽共患寄生虫，其肌幼虫主要寄生于横纹肌，成虫寄生于小肠黏膜。Gilbert等发现旋毛虫肌幼虫和小鼠骨骼肌中的脂肪酸成份相似，但是不同脂肪酸占总脂肪酸的比例具有显著差异[1]。其他寄生蠕虫体内的脂肪酸成份与在其宿主寄生部位的脂肪酸有明显的关系，如曼氏血吸虫和马来丝虫等，可随宿主食物的改变而改变，但与宿主的脂肪酸组成和作用有明显不同[2-3]。脂肪酸不仅是寄生虫细胞膜的重要组成成分，而且在虫体的营养吸收、生长发育以及抵御宿主抗寄生虫反应等方面发挥着重要作用[4]。因此，本研究应用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对旋毛虫肌幼虫和成虫及各自寄生部位的脂肪酸成份进行分析，比较旋毛虫肌幼虫与成虫之间的脂肪酸组分的差异，为研究旋毛虫的脂肪酸合成与代谢以及与宿主间的相互关系奠定基础，并为开发抗旋毛虫药物和研制疫苗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 虫种及实验动物 旋毛虫隔离种由本教研室保种；昆明小鼠20只，雌雄各半，体质量为20 g左右，购自哈尔滨医科大学。

1.2 主要试剂及仪器 RS-Fluka Methyl Tricosanoate、RS-Aldrich Boron Trifluoride-Methanol-Complex 和RS-Supelco Supelco 37 componet Fame Mix均购自Sigma公司；Agilent 6890/5973型气相色谱-质谱联用仪为美国安捷伦科技有限公司产品；OA-SYS/NEVAP氮吹仪为美国Organomation Associates Jnc公司产品。

1.3 样本的制备 取旋毛虫肌幼虫，经口感染10只成年健康昆明小鼠，感染量为200条/只，对照组10只口服生理盐水，分别饲养。小鼠于感染后7 d和35 d迫杀，收集成虫和肌幼虫，同时采集对照组小鼠的骨骼肌和肠黏膜。

1.4 脂肪酸的提取及甲酯化 分别称取旋毛虫肌幼虫、成虫、小鼠骨骼肌和肠黏膜各50 mg，低温真空干燥。样品在玻璃匀浆器中进行均质化，按照文献[5]方法提取总脂类，甲酯化后，加入1 mL正己烷和少量生理盐水，静止分层，吸取上层正己烷相进行GC-MS分析。

1.5 色谱分析程序 60℃2 min；以10℃/min的速率升温至190℃，保持2 min；以4℃/min的速率升温至240℃，保持5 min，实验共计34.5 min。分析所得总离子流色谱图均以峰面积归一法进行定量，以Agilent 5973 MSD Chemstation date analysis system进行数据处理，并按照文献[6]方法进行精密度试验。

2 结果

2.1 方法的精密度 按照文献[6]方法验证其精密度，经对各主要脂肪酸含量测定与分析，5次进样的变异系数均小于5.0%，表明精密度较高。

2.2 样品中脂肪酸定性分析 采用色谱分析方法，分别对FAMEs标准品(图1)、旋毛虫肌幼虫和成虫的脂肪酸以及小鼠骨骼肌和肠黏膜的脂肪酸组成进行GC-MS定性分析(图2)。其中FAMEs标准品分析结果表明：检出C8～C24之间的35种脂肪酸甲酯，但未检出C4∶0和C6∶0。利用NIST检索和标准品的质谱图对4种样品的质谱图进行比较分析，结果显示：旋毛虫肌幼虫、成虫与小鼠骨骼肌、肠黏膜中的主要脂肪酸为在碳链长度上主要分布于C12～C22的多种脂肪酸；各色谱峰所代表的脂肪酸种类见图2。

2.3 样品中脂肪酸定量分析 采用色谱分析方法，对旋毛虫肌幼虫和成虫的脂肪酸、感染旋毛虫的小鼠骨骼肌与肠黏膜的脂肪酸组成及脂肪酸甲酯进行定量分析(表1)。结果显示：旋毛虫肌幼虫、成虫与小鼠骨骼肌、肠黏膜中所含的主要脂肪酸种类基本相同，只有少数脂肪酸在性质和数量上略有不同。

旋毛虫肌幼虫、成虫与小鼠骨骼肌、肠黏膜的饱和脂肪酸相对含量分别为59.36%±0.72%、48.67%±0.69%、45.68%±0.28%和 44.5%±0.82%，其中主要饱和脂肪酸的相对含量为C18∶0和C16∶0；单不饱和脂肪酸的相对含量分别为16.3%±0.36%、44.65%±0.86%、26.82%±0.39%和13.08%±0.21%，以C18∶1为主；多不饱和脂肪酸的相对含量分别为23.84%±0.31%、6.68%±0.15%、27.48%±0.32%和42.05%±0.72%，其中以C18∶2和 C20∶4 为主。

部分样品中痕量检出 C20∶2、C20∶3 和 C22∶2。在旋毛虫肌幼虫和小鼠骨骼肌、肠黏膜脂肪酸组分中检出长链多不饱和脂肪酸C22∶5和C22∶6，相对含量分别为 1.17%±0.01%、1.17%±0.03%，2.06%±0.03%、5.63%±0.05%和1.36%±0.02%、3.17%±0.02%。然而，在成虫体内未检出该长链多不饱和脂肪酸的存在。C22∶6分别占旋毛虫肌幼虫和小鼠骨骼肌、肠黏膜多不饱和脂肪酸的4.9%、20.49%和7.54%。

3 讨论

本研究采用GC-MS对旋毛虫肌幼虫和成虫及其寄生部位的脂肪酸成份和甲酯化进行分析，结果显示：4种样品中的脂肪酸大部分为偶数脂肪酸，主要分布于C16、C18和C20中，涵盖了各自总脂肪酸的90%以上。旋毛虫肌幼虫中饱和脂肪酸比例明显高于成虫和骨骼肌，这可能与肌幼虫在肌肉组织中以包囊的形式寄生有关，即不直接与周围组织接触，但是肌幼虫的能量摄取又来自于周围的肌组织。因此，肌幼虫与骨骼肌之间的脂肪酸组成既有相似点又存在明显地差异。

表1 旋毛虫肌幼虫、成虫和小鼠骨骼肌、肠黏膜的总脂类中的脂肪酸组成(X±SD，n=5)Table 1 Fatty acid composition of the total lipids of T.spiralismuscle larvae,adults,mouse skeletal muscle and intestinal mucosa(X±SD,n=5)

肌幼虫中C20∶4相对含量明显高于成虫及骨骼肌中C20∶4的含量，这可能与肌幼虫寄生于小鼠横纹肌时C20∶4参与抵御外界炎症反应以及自身信号传导有关。肠黏膜中C20∶4的含量也较高，这也证明了C20∶4在炎症反应中的重要作用。

成虫的主要脂肪酸为C16∶0和C18∶1，相对含量均明显高于肌幼虫，原因可能是成虫为快速的生长、发育和繁殖，从宿主的食物中获取丰富的营养物质，而肌幼虫只需维持正常的生命活动。因此，旋毛虫在不同的发育阶段脂肪酸组成存在差异。成虫中不饱和脂肪酸相对含量较高，这可能与小鼠食物中的营养成分有关。成虫既从肠黏膜周围获取能量，又要抵御肠黏膜的炎性反应。因此从某种意义上成虫的脂肪酸组成与肠黏膜必然存在差异。

本研究表明旋毛虫肌幼虫含有少量的长链多不饱和脂肪酸，如C22∶5和C22∶6。这些多不饱和脂肪酸可能在肌幼虫的生长发育过程中发挥着重要的作用。Ripatti等发现耐寒虫种本地旋毛虫含有足量的C22∶5和C22∶6，在抵御寒冷方面发挥着至关重要的作用[7]。然而，肌幼虫如何获得这些长链多不饱和脂肪酸，目前未见报道。

近年来，研究人员发现旋毛虫肌幼虫具有抗肿瘤作用[8]，而C22∶6也同样被证明具有提高免疫力、抑制肿瘤细胞发育的作用[9]，C22∶6是否是旋毛虫发挥抑制肿瘤作用的重要因素之一，还有待于进一步研究。本研究为研究旋毛虫发育过程中脂肪酸的变化提供依据，并且为进一步研究旋毛虫的脂肪酸合成代谢机制提供思路，对开发新的抗旋毛虫药物和研制疫苗具有重要的意义。

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