复方痤疮微乳膏对兔耳痤疮模型的实验研究

王菊荣，李明春，王冬冬，张 伟（解放军第401医院，青岛市 266071）

痤疮发病原因比较复杂，主要与雄性激素分泌亢进，痤疮丙酸杆菌侵入，毛囊、皮脂腺导管角化栓塞密切相关。目前，治疗痤疮的外用制剂种类繁多，有霜剂、凝胶剂、洗剂、酊剂、搽剂等。制剂多为单方[1]或只具备一、两方面药理活性药物组成的复方[2，3]，尚未有既含有抗菌药物和抑制油脂分泌的药物，又含有维甲酸类溶解角质的复方药剂。中成药方剂多以清热解毒为治疗基础[4]，也未能全面对抗痤疮的诸多病因，所以大多药物制剂只对轻、中度痤疮疗效较好，对重度痤疮的治疗，常需要多种制剂联合应用[5～7]。故此，笔者选择临床治疗痤疮疗效较好、价格合适、容易得到的阿奇霉素[8]、螺内酯[2]、维A酸组方，依据微乳理论和乳膏制备工艺，制备具有微乳特性的“复方痤疮微乳膏”，将3种药物分别以纳米粒形式分散于微乳剂中，达到良好的相容性和稳定性。2008年12月31日中华人民共和国国家知识产权局授予其“发明专利”，专利号：ZL 2006 1 0044001.1，证书号：第456920号。为探讨该制剂疗效，进行实验研究如下。

1 材料

1.1 试药

高、低浓度复方痤疮微乳膏（批号：20090325、20090329，含量：阿奇霉素0.5%、0.4%，螺内酯0.25%、0.2%，维A酸0.035%、0.025%）、阿A微乳膏（批号：20090326，含量：阿奇霉素0.4%、维A酸0.025%）均由解放军第401医院提供；维A酸乳膏（迪维霜，重庆华邦制药股份有限公司，批号：2008098，含量：0.025%）；煤焦油（黑色黏稠状，青岛市煤气公司），其稀释液为煤焦油-液体石蜡油（1∶1）混合后取上清液；美加净护手霜（市售，有效期至2012-11-25）。

1.2 动物

成年新西兰大白兔20只，♀、♂各半，体质量2.5～3.0 kg，成对隔栏饲养，由青岛市实验动物和动物实验中心提供，合格证号：SCXK鲁（20090007）。

1.3 仪器

BX-51型显微摄影器材（日本Olympus公司）。

1.4 菌落

表皮葡萄球菌稀释液（解放军第401医院提供，批号：ATCC12228，浓度：108个·mL－1）。

2 方法

2.1 分组

20只兔，2只为空白对照组，18只为实验组，再将实验组随机分为3组，每组6只，♀、♂各半，第1组左耳设为A组，右耳设为B组，第2组左耳设为C组，右耳设为D组，第3组左耳设为E组，右耳设为F组。

2.2 模型建立

每天涂煤焦油稀释液0.25 mL于实验组兔耳内侧耳管开口处2 cm×2 cm范围，连涂15 d，次日将表皮葡萄球菌稀释液30µL涂于兔耳，再继续涂煤焦油稀释液7 d，然后饲养5 d，共计造模时间28 d。

2.3 给药

A组，外涂高浓度复方痤疮微乳膏作为实验1组；B组，外涂阿A微乳膏作为实验对照组；C组，外涂低浓度复方痤疮微乳膏作为试验2组；D组，外涂迪维霜作为阳性对照组；E组，外涂美加净护手霜作为阴性对照组；F组不涂任何药物作为模型对照组。各组模型兔耳涂药量均为（0.5±0.05）g·d－1，连续用药14 d。

2.4 评价

2.4.1 肉眼判断。给药前、后用照相机和手指触摸记录凸起痤疮数量。

2.4.2 组织学判断。给药前，取有代表性的1只兔耳痤疮模型组织；在末次给药后48h，每组取1只兔耳（距边缘10 mm处）痤疮模型组织；均用10%福尔马林固定，石蜡包埋，4µm厚度切片，75%乙醇→无水酒精梯度脱水，HE染色，光学显微镜下观察模型组织状况。

以上评价指标为：“-”表示正常组织，无痤疮；“+”表示表皮增厚，棘上皮细胞增生，痤疮数≤4个；“++”表示表皮增厚，棘上皮增生，真皮内有淋巴细胞，毛囊漏斗部有松散的角化细胞，痤疮数5～7个；“+++”表示毛囊漏斗部显著扩张，角质栓塞，皮脂腺增生，炎性细胞明显，正常组织排列结构被破坏，痤疮数＞7个。

2.5 统计学处理

采用非参数检验方法的秩和检验及t检验[9]。

3 结果

3.1 痤疮模型

3.1.1 肉眼观察。正常兔耳柔软，毛细血管清晰，有良好的透光度，兔耳管开口处为整齐排列的毛囊和纤细的毛发。外涂煤焦油稀释液15 d，兔耳肿胀，毛孔粗大，毛囊角质化增生；涂表皮葡萄球菌液和煤焦油后，兔耳肿胀厚度达4～5 mm，出现较多隆起的丘疹、脓疱，显示有黑色、红色、灰白、灰褐色，直径1～3 mm，高度1～2.5 mm不等。各组模型外观状况相同。

3.1.2 显微镜观察。正常兔耳表皮较薄，1层颗粒细胞层，2～3层棘细胞层，毛囊皮脂腺结构清晰。模型兔耳表皮明显增厚，其棘细胞层增厚显著，毛囊皮脂腺体积增大，表皮角化，毛囊角栓出现，真皮毛细血管扩张，内充满红血球，毛囊周围及间质纤维结缔组织内较多小块状或散在炎性细胞，并有中性粒细胞及嗜酸粒细胞，毛囊上皮增生呈不规则团块状或互相融合，失去正常组织排列结构，凸起痤疮的毛囊扩大，毛囊漏斗部扩大明显，形成角质栓；符合人类痤疮特征。

3.2 涂药后痤疮模型改变情况

3.2.1 肉眼观察。A组，兔耳的肿胀、表皮角化物、痤疮全部消失，基本等同正常皮肤。B组，表皮角化增生层大多数消退，丘疹、脓胞消失，留有印痕，但尚有个别未消退的痤疮及角化增生物。C组，兔耳表皮角化增生物基本消退，表面平滑，痤疮消失，留有轻微印记，触摸无凸起感。D组，兔耳肿胀均减轻，表面角化增生物基本消退，表面光滑，但痤疮凸起明显，手指触摸较硬，直径1～2 mm，高度1～2 mm。E组，兔耳表皮肿胀程度及角化增生略有减轻，痤疮略有缩小，直径1～2.5 mm，高度1～2.0 mm。F组，兔耳表皮角化物变硬，部分皮损干缩，受细菌感染的皮损体积增大。各组模型改变具体情况详见图1。

3.2.2 显微镜观察。A组，表皮组织、毛囊皮脂腺等基本恢复正常。B组，表皮仍有增厚，棘上皮细胞有轻度增生。C组，表皮组织略有增厚，基本等同于正常皮肤。D组，表皮组织有增厚，棘上皮增生，真皮内有淋巴细胞、炎性细胞。E组，兔耳表皮增生及角化明显，炎性细胞清晰可见。F组，毛囊角化扩大，血管扩张，皮脂腺增生明显，炎性细胞增多。具体各组模型组织学改变情况详见图2。

3.3 统计学分析结果

给药前，A、B、C、D、E、F组痤疮模型状况无差异（P＞0.05）。给药后，A、B、C、D、E组均有不同程度的改善，而F组加重，表明此次实验结果可靠。模型评价情况及统计分析见表1。

由表1可知，与E组比较，A、C组有极显著性差异（P＜0.001），B、D组有显著性差异（P＜0.05），说明2个实验组的治疗效果优于阳性对照组和实验对照组。与B组或D组比较，A组有极显著性差异（P＜0.01），C组有显著性差异（P＜0.05），说明高浓度复方痤疮微乳膏的对痤疮模型的治疗作用优于低浓度复方痤疮微乳膏。

图1 各组兔耳涂药前、后外观图a.空白对照；b.A组；c.B组；d.C组；e.D组；f.E组；g.F组Fig 1 Appearance of ears in model rabbit before and after administrationa.blank control；b.group A；c.group B；d.group C；e.group D；f.group E；g.group F

图2 各组兔耳涂药前、后组织切片图（HE，10×10）a.空白对照；b.A组；c.B组；d.C组；e.D组；f.E组；g.F组Fig 2 Histological slice of ear acne model rabbit before and after administratio（nHE，10×10）a.blank control；b.group A；c.group B；d.group C；e.group D；f.group E；g.group F

表1 各组兔耳涂药前、后皮损组织学评价及其统计分析（n＝6）Tab 1 Histological evaluation and statistical analysis of skin lesion in ear of acne model rabbit before and after administration（n＝6）

4 讨论

在预实验中，用煤焦油0.5 mL每天外涂兔耳[10，11]，14 d后形成厚厚的煤焦油结痂，结痂粘连着表皮，难以揭去，饲养数日后，去掉结痂仅有微小的黑色角栓，无肉眼可见的隆起样痤疮。分别给予复方痤疮微乳膏和迪维霜2周，结果各兔耳增厚的角质以及轻度角栓均能完全消失，恢复正常，实验组与对照组无明显差别。可见煤焦油刺激引起的兔耳角化增生及轻度角质栓，迪维霜完全能对抗。但人类痤疮往往伴随着油脂分泌和细菌感染。而煤焦油过于黏稠，连续涂抹数次后，形成煤焦油结痂层，后续涂煤焦油就难以渗透进入皮内，导致模型角质栓塞化程度不够，达不到人类痤疮的病理状况。因此实验采用液体石蜡油稀释煤焦油，令其渗透性增加，促使兔耳肿胀加速，细菌容易浸入，使建立的痤疮模型更接近人类痤疮。

实验中虽未实施雄性激素指标，但将兔子成对隔栏饲养，兔子处于发情期状态，兔耳肿胀程度较单独饲养明显加快，尤其雄性兔耳角质增厚更明显，丘疹、脓胞体积大，数量多；并且在实验中增设对照组，给予不含螺内酯的制剂——阿A微乳膏，考察维A酸与抗菌药物组合对模型痤疮的治疗作用。结果，复方痤疮微乳膏优于阿A微乳膏，确证治疗痤疮的制剂中不可缺少对抗雄性激素的药物，因此螺内酯在该处方中不可缺少。

涂药结束1周后，实验组兔耳的结痂、印记全部消失，与正常兔耳无异。阳性对照组则仍留有凸起的硬结节，继续饲养2个月未见消退。其原因可能是迪维霜为普通乳剂，且只含有维A酸单一药物，因此仅对表皮角化增生物的作用显著，而对皮下细菌感染和油脂栓塞的作用较弱。实验药物采用微乳剂型，微乳剂较普通乳剂更容易携带药物进入皮下组织，药效作用是由里向外进行的；所以停药后会有后效应，愈后效果显著。

综上所述，复方痤疮微乳膏是含有抑制细菌、对抗雄性激素和溶解角质3种药物的制剂，可同时产生3方面的药理作用，构成一个立体治疗体系，协同对抗痤疮的病因，故而治疗效果较好。

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